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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.100.2020.tde-09012020-151229
Document
Author
Full name
Suelen de Barros Sampaio
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Chambergo Alcalde, Felipe Santiago (President)
Costa, Sirlene Maria da
Laporta, Marcia Zorello
Salinas, Roberto Kopke
Title in Portuguese
Produção, purificação e caracterização da enzima lacase do fungo Cochliobolus sativus
Keywords in Portuguese
Cochliobolus
Bagaço da cana-de-açúcar
Biomassa lignocelulósica
Enzima
Fungo
Oxidorredutases
Abstract in Portuguese
O aumento na demanda mundial por etanol atrelado a preocupações ambientais relacionadas ao desbalanceamento de carbono na atmosfera em decorrência da utilização de combustíveis fósseis, impulsionou o interesse por combustíveis renováveis. O bagaço da cana-de-açúcar é constituído principalmente por lignina, hemicelulose e celulose, estes dois últimos podem ser decompostos e fermentados em etanol. Durante a hidrólise da biomassa lignocelulósica ocorre a ação sinergética de um complexo enzimático para obter os açúcares solúveis fermentáveis, no qual recentes pesquisas têm demonstrado a importância das enzimas oxidorredutases na despolimerização da lignina. O objetivo desse estudo foi identificar o fungo filamentoso BBF210, avaliar sua utilização na produção de lacase em meio de cultura contendo bagaço de cana-de-açúcar, purificar e caracterizar a oxidorredutase deste fungo, além de expressar e purificar a enzima lacase recombinante. Por análise de taxonomia clássica e molecular o fungo filamentoso BBF210 foi identificado como produtor de enzimas oxidorredutases, pertencente à espécie Cochliobolus sativus. A análise computacional do genoma de C. sativus, permitiu a identificação do cDNA do gene com 1575 pb, que codifica a putativa enzima lacase de 524 aminoácidos e massa molecular estimada em 57,7 kDa. O gene foi sintetizado e clonado nos vetores (pET, pTrc e pFLAG), para expressão em E. coli. A enzima lacase recombinante foi expressa e purificada. O fungo C. sativus foi avaliado quanto à sua capacidade de produzir oxidorredutases em meio de cultura MSB (caldo de cultura com sais minerais) contendo 0,5% de bagaço de cana-de-açúcar e os resultados mostraram uma maior atividade da enzima lacase com o substrato ABTS, quando comparado às peroxidases. Após o 7º dia de cultivo a enzima foi precipitada com etanol a 50% e purificada em duas etapas por cromatografia de troca iônica (coluna Q-sepharose). A fração pura de lacase apresentou 3.264,32 U/L e 11,25 U/mg. Os resultados sugerem que a proteína nativa é uma isoenzima com massa molecular de aproximadamente 50 kDa, similar à proteína recombinante, como confirmado em análise por western blot. A atividade de lacase nativa foi determinada com o substrato ABTS por zimograma e espectrofotometria, com as constantes catalíticas Km= 0,094 mM e Vmax= 1,62 mM s-1. O pH e temperatura ótimos da enzima foram determinados como sendo 4,0 e 30ºC, respectivamente, com estabilidade térmica a 30°C e temperatura ideal na faixa entre 10 e 50°C. Sendo a lacase uma oxidorredutase fundamental no processo de degradação da biomassa vegetal, o presente estudo fornece informações sobre a enzima expressa por C. sativus e descreve pela primeira vez a produção, purificação e caracterização da enzima nativa deste fungo. O conhecimento de suas características e propriedades bioquímicas podem ser importantes para investigações científicas mais aprofundadas em torno da identificação e caracterização da enzima e colaborar para a otimização de processos que utilizam oxidases em coquetéis enzimáticos, tanto para a produção de etanol utilizando a metodologia 2G quanto para outros processos biotecnológicos
Title in English
Production, purification and characterization of the laccase enzyme of the fungus Cochliobolus sativus
Keywords in English
Cochliobolus
Enzyme
Fungi
Lignocellulosic Biomass
Oxidoreductases
Sugarcane bagasse
Abstract in English
The increase in global demand for ethanol is linked to concerns about carbon imbalance in the atmosphere due to the use of fossil fuels, driven by the interest in renewable energy sources. Sugar cane sugar consists mainly of lignin, hemicellulose and cellulose, the latter two of which can be broken down and fermented in ethanol. During the hydrolysis of lignocellulosic biomass there is a synergistic action of an enzymatic complex to obtain soluble fermentable sugars, in which recent research has demonstrated the importance of oxidoreductase enzymes in lignin depolymerization. The objective of this study was to identify the filamentous fungus BBF210, to evaluate its use in the production of laccase in a culture medium containing sugarcane bagasse, to purify and characterize the oxidoreductase of this fungus, as well as to express and purify the recombinant lacase enzyme. By classical and molecular taxonomy analysis the filamentous fungus BBF210 was identified as a producer of oxidoreductase enzymes belonging to the species Cochliobolus sativus. The computational analysis of the C. sativus genome allowed the identification of the gene cDNA with 1575 bp, that encodes the putative 524 amino acid laccase enzyme and estimated molecular weight of 57,7 kDa. The gene was synthesized and cloned into vectors (pET, pTrc and pFLAG) for expression in E. coli. A recombinant lacase enzyme was expressed and purified. The fungus C. sativus was evaluated for its ability to produce oxidoreductases in MSB (mineral salts broth) culture medium containing 0,5% sugarcane bagasse and the results showed a higher activity of laccase enzyme with ABTS substrate when compared to peroxidases. After the 7th day of cultivation the enzyme was precipitated with 50% ethanol and purified in two steps of ion exchange chromatography (Q-sepharose column). The pure laccase fraction presented 3,264.32 U/L and 11,25 U/mg. The results suggest that the native protein is a isoenzyme with about 50 kDa, similar to the recombinant protein, as confirmed by western blot analysis. Native laccase activity was determined with ABTS substrate by zymogram and spectrophotometry, with catalytic constants Km = 0.094 mM and Vmax = 1.62 mM s-¹. The optimal pH and temperature of the enzyme were determined as being 4.0 and 30ºC, respectively, with thermal stability at 30°C and ideal temperature in the range between 10 and 50°C. Since laccase is a fundamental oxidoreductase in the degradation process of plant biomass, the present study provides information about enzyme expressed by C. sativus and whose production, purification and characterization of the native enzyme of this fungus is describes for the first time. Knowledge of their biochemical characteristics and properties may be important for further scientific investigations around the identification and characterization of enzymes and for the optimization of processes using enzymatic cocktail with oxidases, both for ethanol production using the 2G methodology and for other biotechnological processes
 
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Publishing Date
2020-01-29
 
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