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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.10.2022.tde-19012023-155422
Documento
Autor
Nome completo
Gisely Toledo Barone
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2022
Orientador
Banca examinadora
Brandão, Paulo Eduardo (Presidente)
Aires, Caroline Cotrim
Clavijo, Nelson Fernando Santana
Silva, Emmanuel Messias Vilar Gonçalves da
Soares, Rodrigo Martins
Título em português
Um estudo sobre a filogenia de Chiroptera e sua coevolução com vírus da raiva
Palavras-chave em português
Chiroptera
Códons
Coevolução
Filogenia
Raiva
Resumo em português
A raiva é uma encefalite viral aguda e quase sempre fatal, tem distribuição global e causa cerca de 59 mil mortes/ano, principalmente em crianças de países em desenvolvimento. Provocada pelo Lyssavirus rabies (RABV) - vírus de genoma RNA, formado por cinco genes (N, P, M, G e L), é um dos mais antigos patógenos já descritos pela humanidade, capaz de acometer todos os mamíferos, mas mantém os morcegos (Chiroptera) como hospedeiro reservatório. Os quirópteros são os únicos mamíferos com capacidade para voar, o que os possibilita percorrer grandes distâncias e facilita a disseminação de vírus, como o RABV. Com o intuito de comparar a taxonomia morfológica e molecular de quirópteros, foi realizado o sequenciamento parcial do gene COI de 384 indivíduos, utilizando o SNC de diversas espécies do Estado de São Paulo. Todas as sequências foram depositadas e se encontram disponíveis no banco de dados GenBank (NCBI). A identificação genética das espécies pelo gene COI (DNA barcoding) foi resultado do sistema BOLD de identificação, as relações filogenéticas entre os indivíduos foram avaliadas com a elaboração de árvores de Máxima Verossimilhança e com análise dos parâmetros de diversidade genética (número de haplótipos, número de sítios variáveis, diversidade haplotípica e nucleotídica), além da construção das redes de haplótipos, incluindo sequências do gene COI disponíveis em banco de dados. Durante o estudo, foram encontrados indivíduos com sequências do gene COI idênticas, separados por mais de 3mil km de distância geográfica. Diferenças significativas entre a taxonomia morfológica e molecular do gênero Myotis foram destacadas, evidenciando a necessidade do uso de marcadores moleculares na identificação de espécies, principalmente as mais complexas. Em paralelo, o viés de uso de códons foi avaliado no genoma completo de RABV, utilizando 51 sequências de isolados já disponíveis em banco de dados. O mRNA da β-actina foi eleito para gerar 43 sequências parciais de quirópteros e utilizá-las como conjunto de referência de genes altamente expressos, empregados na análise dos indicadores de uso de códons, além de gerar a filogenia baseada em β-actina. Índices como conteúdo GC, RSCU, Enc, CAI e RCDI foram calculados, a fim de avaliar o viés de uso e inferir a força evolutiva que o influencia, apesar de RABV apresentar baixo viés de utilização. Valores de RSCU foram convertidos em dados binários e possibilitaram gerar cinco árvores de Neighbor- Joining. Um ensaio in vivo foi realizado em camundongos inoculados com amostra de quiróptero positivo para raiva, com finalidade de comparar a carga viral na mudança de hospedeiros e verificar suas implicações no uso de códons. De maneira geral, RABV mostrou-se um vírus de baixo viés de uso de códons, preferindo utilizar os terminados em A/T, além de indicar que o viés é influenciado pela seleção natural. Os padrões de uso de códons são diretamente influenciados pela coevolução entre vírus e hospedeiros.
Título em inglês
A study on the phylogeny of Chiroptera and its coevolution with rabies virus
Palavras-chave em inglês
Chiroptera
Codons
Coevolution
Phylogeny
Rabies
Resumo em inglês
Rabies is an acute and almost always fatal viral encephalitis, has a global distribution and causes about 59,000 deaths/year, mainly in children in developing countries. Caused by Lyssavirus rabies (RABV) - an RNA genome virus, formed by five genes (N, P, M, G and L), it is one of the oldest pathogens ever described by humanity, capable of affecting all mammals, but maintaining the bats (Chiroptera) as a reservoir host. Chiropterans are the only mammals capable of flying, which allows them to travel great distances and facilitates the spread of viruses such as RABV. In order to compare the morphological and molecular taxonomy of bats, a partial sequencing of the COI gene of 384 individuals was performed, using the CNS of several species from the State of São Paulo. All sequences have been deposited and are available in the GenBank database (NCBI). The genetic identification of species by the COI gene (DNA barcoding) was the result of the BOLD identification system, the phylogenetic relationships between individuals were evaluated with the elaboration of Maximum Likelihood trees and with the analysis of genetic diversity parameters (number of haplotypes, number of variable sites, haplotypic and nucleotide diversity), in addition to the construction of haplotype networks, including sequences of the COI gene available in the database. During the study, individuals with identical COI gene sequences were found, separated by more than 3,000 km of geographic distance. Significant differences between the morphological and molecular taxonomy of the genus Myotis were highlighted, pointing to the need to use molecular markers to identify species, especially the more complex ones. In parallel, the codon usage bias was evaluated in the complete genome of RABV, using 51 sequences of isolates already available in the database. The β-actin mRNA was chosen to generate 43 partial sequences of chiropterans and use them as a reference set of highly expressed genes, used in the analysis of indicators of codon usage, in addition to generating the β-actin-based phylogeny. Indices such as GC, RSCU, Enc, CAI and RCDI content were calculated in order to assess the usage bias and infer the evolutionary force that influences it, despite the fact that RABV has a low usage bias. RSCU values were converted into binary data and made it possible to generate five Neighbor-Joining trees. An in vivo assay was carried out in mice inoculated with a sample of chiroptera positive for rabies, in order to compare the viral load in the change of hosts and to verify its implications in the use of codons. In general, RABV was shown to be a virus with low codon use bias, preferring to usage codons ending in A/T, in addition to indicating that the bias is influenced by natural selection. Codon usage patterns are directly influenced by coevolution between viruses and hosts.
 
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Data de Publicação
2023-02-02
 
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