• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.10.2018.tde-12072018-145115
Document
Author
Full name
Ryan Emiliano da Silva
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2018
Supervisor
Committee
Marcili, Arlei (President)
Moraes Filho, Jonas
Tonhosolo, Renata
Title in Portuguese
Genes de cisteíno proteases (catepsina L-like) de Leishmania infantum chagasi: caracterização, relações filogenéticas e diagnóstico molecular
Keywords in Portuguese
Cães
Diagnóstico Molecular
Filogenia
Leishmaniose Visceral
Zoonose
Abstract in Portuguese
Os parasitas pertencentes ao gênero Leishmania têm distribuição ubíqua. Este táxon inclui Leishmania infantum chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, uma zoonose negligenciada cujas metodologias diagnósticas acumulam uma série de limitações, requerendo a validação e padronização de metodologias diagnósticas satisfatórias. Vários fatores estão relacionados à patogênese causada por este protozoário, entre eles a catepsina L-like, uma cisteíno protease envolvida em processos regulatórios metabólicos e infecciosos. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do gene de catepsina L-like isoforma CPA como alvo de diagnóstico molecular e como marcador filogenético que permita a compreensão das variações intraespecíficas e elucidem a história evolutiva de L. infantum chagasi no Brasil. Foram utilizados 44 isolados de L. infantum chagasi de diferentes estados brasileiros. Os fragmentos do gene de catepsina L-like foram amplificados, purificados, sequenciados, alinhados manualmente e analisados por métodos filogenéticos de máxima parcimônia e inferência bayesiana. As sequências geradas foram usadas para pesquisar e sintetizar iniciadores a serem usados em reações específicas para o parasita alvo. O gene de catepsina L-like não mostrou variabilidade intraespecífica entre os isolados analisados, sugerindo um evento recente de introdução do mesmo nas Américas. O par de iniciadores propostos amplificou o DNA alvo de isolados de L. infantum chagasi, sendo efetivo na amplificação de DNA em concentrações de até 10-11g / µl. O marcador proposto não apresentou reações cruzadas com outros hemoparasitas de importância clínica. Quando utilizado para o diagnóstico em um painel de amostras clínicas de cães, obteve-se uma frequência de positividade de 49,03% (102/208), contrastando com o valor de 14,42% (30/208) obtido com o marcador para o gene do espaçador ribossomal interno ITS. Quando testado em amostras de flebotomíneos se obteve um valor de 6,25% e em amostras de pacientes humanos o valor foi de 14,28%. Os marcadores também foram eficazes em amplificar DNA extraído de amostras de urina, de sangue fixado em papel filtro e mesmo em amostras de swab de lesões conjuntivas. Este conjunto de parâmetros permite inferir que o CatLeish- PCR é sensível e específico para o diagnóstico de L. infantum chagasi podendo ser aplicado tanto em pesquisas clínicas quanto em inquéritos epidemiológicos de vigilância.
Title in English
Genes of Cysteine proteases (Cathepsin L-like) from Leishmania infantum chagasi: characterization, phylogenetic relations and molecular diagnosis
Keywords in English
Dogs
Molecular Diagnosis
Phylogeny
Visceral Leishmaniasis
Zoonotic Diseases
Abstract in English
The parasites belonging to the Leishmania genus have a wide distribution. This taxon includes Leishmania infantum chagasi, the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis in the Americas, a neglected zoonosis that requires the validation and standardization of satisfactory diagnostic methodologies. Several factors are related to the pathogenesis caused by this protozoan, as Catepsin L-like, a cysteine protease involved in regulatory and infectious processes. Given this information this work aimed to evaluate the effectiveness of Cathepsin L-like isoform CPA as a target for molecular diagnosis and as a phylogenetic marker that allows understanding the intraspecific variations and the evolutionary history of L. infantum chagasi in Brazil. We used 44 isolates of L. infantum chagasi from different Brazilian states. The cathepsin L-like gene fragments were amplified, purified, sequenced, manually aligned and analyzed by maximum parsimony and Bayesian inference methods. The sequences generated were researched to construction of oligonucleotide primers to be used in reactions specific to the target parasite. The Cathepsin L-like gene did not show intraspecific variability among the isolates analyzed, suggesting a recent event of introduction of the same in the Americas. The pair of proposed primers amplified the target DNA of L. infantum chagasi isolates, being effective in DNA amplification at concentrations of up to 10-11g/µl. The proposed marker did not present cross-reactions with other hemoparasites of clinical importance. When used for the diagnosis in a panel of clinical samples of dogs obtained a positive frequency of 49.03% (102/208), against the 14.42% (30/208) to ribosomal ITS marker. Samples of sandflies obtained a value of 6.25% and in humans the value was 14.28%. The markers were also effective in blood samples fixed on filter paper and even in samples from conjunctival lesion swabs. This set of parameters allows to infer that CatLeish-PCR is a sensitive and specific marker for the diagnosis of L. infantum chagasi in clinical and epidemiological surveys.
 
WARNING - Viewing this document is conditioned on your acceptance of the following terms of use:
This document is only for private use for research and teaching activities. Reproduction for commercial use is forbidden. This rights cover the whole data about this document as well as its contents. Any uses or copies of this document in whole or in part must include the author's name.
Publishing Date
2018-08-31
 
WARNING: Learn what derived works are clicking here.
All rights of the thesis/dissertation are from the authors
CeTI-SC/STI
Digital Library of Theses and Dissertations of USP. Copyright © 2001-2021. All rights reserved.