A tuberculose (TB) é uma doença de humanos e animais causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC). Apesar da alta similaridade genética, patógenos do MTBC apresentam variações em predileção hospedeira e virulência. Aqueles adaptados aos humanos incluem Mycobacterium tuberculosis (M.tb), distribuído mundialmente, e Mycobacterium africanum L5 e L6, restritos ao oeste africano. Dentre espécies adaptadas aos animais, destacam-se Mycobacterium bovis e Mycobacterium caprae, principais causadores da TB bovina e zoonótica, capazes de infectar diversas espécies hospedeiras, incluindo humanos. Outra micobactéria tuberculosa de importância, que não faz parte do MTBC, é o Mycobacterium canettii, oriunda de um ancestral comum ao MTBC e identificada causando TB em humanos no leste africano. Esses são os patógenos de maior relevância para TB humana, sendo a doença zoonótica ou não. Independente do ecotipo bacteriano, a principal característica da patogênese das micobactérias tuberculosas é sua capacidade de sobreviver no interior de macrófagos por meio da manipulação das vias microbicidas. Por consequência, a persistência intracelular dessas bactérias leva a apoptose ou necrose dos macrófagos, contribuindo para controle ou disseminação da infecção. Diversos estudos avaliaram a interação de M.tb com macrófagos e sua persistência intracelular, porém, poucos incluem outros representantes do MTBC. Assim, os objetivos deste estudo foram inicialmente (i) desenvolver uma metodologia de quantificação de bactérias do MTBC (M.tb, M. africanum L5 e L6, M. bovis, M. caprae) e M. canettii por citometria de fluxo, para facilitar o desenvolvimento dos experimentos e, em seguida, (ii) comparar as dinâmicas da infecção das espécies de MTBC e M. canettii em macrófagos THP-1 avaliando a taxa de infecção, índice de fagocitose e morte celular. Primeiramente, verificamos que a quantificação por UFC (unidades formadoras de colônias) de M.tb em meio sólido Middlebrook 7H10 ou 7H9-Ágar suplementados com 10% de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose e catalase) e 18 mM de piruvato de sódio é cerca de 10 vezes maior que as outras espécies do MTBC e M. canettii. Para compreender essa discrepância, o citômetro de fluxo LSR Fortessa™ Cell Analyzer (BD Biosciences) foi empregado para quantificar as bactérias cultivadas em meio líquido comparando duas metodologias de fluorescência: marcação com CF-SE (5-(e-6) carboxyfluorescein, succinilmidyl ester) e transformação com plasmídeo pMSP::dsRed2. Enquanto o CF-SE marcou apenas 40 a 80% das bactérias, dsRed2 foi expresso em ˜100% das populações bacterianas. Bactérias-dsRed2 puderam então ser quantificadas com acurácia pela citometria de fluxo após ajustes em threshold de PE (phycoerythrin) e voltagem PMT (tubo fotomultiplicador) de FSC (forward scatter) para a diminuir a oscilação do equipamento e a taxa de aborto de eventos, com baixo false discovery rate (FDR) e coeficientes de variações entre replicatas. Com a nova metodologia, as quantificações por UFC e citometria de fluxo mostraram-se equivalentes para M.tb, mas significativamente diferentes nas outras espécies avaliadas, indicando que o meio sólido não é capaz de suportar o crescimento adequado de espécies não-M.tb. Em seguida, com o novo protocolo de quantificação bacteriana, comparamos as taxas de infecção e os índices de fagocitose em macrófagos THP-1 das bactérias do MTBC e M. canettii utilizando diferentes multiplicidades de infecção (MOIs de 2:1, 5:1, 10:1 e 20:1). Ambos os índices se comportaram de forma dose-dependente para todas as espécies, exceto para M. caprae, que apresentou índices semelhantes em todas as MOIs, em níveis que só foram obtidos em MOIs mais elevadas (10:1 e 20:1) pelas outras espécies do MTBC. Adicionalmente, os índices de M. canettii superaram significativamente os das espécies do MTBC em todas as MOIs. Para explicar este achado, sequenciamos o genoma completo de M. canettii e mostramos que a estirpe testada perdeu uma das cópias do gene pks5 (policetídeo sintase 5) responsável pela síntese de lipooligossacarídeos. A perda espontânea deste gene tem sido associada a uma maior infectividade de M. canettii em macrófagos, explicando os achados. Por fim, os níveis de morte celular avaliados durante 96h indicam que M. bovis e M. caprae induzem níveis maiores de apoptose 24h p.i. em macrófagos THP-1. À medida que a infecção progride, os níveis de necrose aumentam, entretanto M. caprae superou todas as espécies em 72h e 96h de infecção. Em conclusão, esse é um estudo comparativo entre as espécies do MTBC que traz importantes contribuições metodológicas e de entendimento da infecção do macrófago por espécies do MTBC e M. canettii.

Tuberculosis (TB) is a human and animal disease caused by bactérias belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Despite high genetic similarity, MTBC pathogens show variance in host predilection and virulence. Those adapted to humans include Mycobacterium tuberculosis (M.tb), distributed worldwide, and Mycobacterium africanum L5 and L6, restricted to West Africa. Among animal-adapted species, Mycobacterium bovis and Mycobacterium caprae standout, the main causatives of bovine and zoonotic TB, capable of infecting several host species, including humans. Another tuberculous mycobacteria of importance, which is not part of MTBC, is Mycobacterium canettii, originating from a common ancestor to MTBC and identified as causing TB in humans in East Africa. These are the most relevant pathogens for human TB, whether the disease is zoonotic or not. Regardless of the bacterial ecotype, the main feature of the pathogenesis of tuberculous mycobacteria is their ability to survive inside macrophages by manipulating microbicidal pathways. Consequently, the intracellular persistence of these bacteria leads to apoptosis or necrosis of macrophages, contributing to the control or dissemination of the infection. Several studies evaluated the interaction of M.tb with macrophages and its intracellular persistence, however, few include other MTBC representatives. Thus, the objectives of this study were initially (i) to develop a methodology for quantification of MTBC species (M.tb, M. africanum L5 and L6, M. bovis, M. caprae) and M. canettii by flow cytometry, to facilitate the development of experiments and then (ii) to compare the dynamics of infection of MTBC and M. canettii species in THP-1 macrophages evaluating the infection rate, phagocytosis index and cell death. First, we verified that the quantification by CFU (colony forming units) of M.tb in solid media Middlebrook 7H10 or 7H9-Agar supplemented with 10% OADC (oleic acid, albumin, dextrose and catalase) and 18 mM of sodium pyruvate it is about 10 times larger than the other MTBC species and M. canettii. To understand this discrepancy, the LSR FortessaTM Cell Analyzer flow cytometer (BD Biosciences) was used to quantify bacteria cultured in liquid medium comparing two fluorescence methodologies: staining bacteria with CF-SE (5-(e-6) carboxyfluorescein, succinylmidyl ester ) and transformation with plasmid pMSP::dsRed2. While CF-SE marked only 40 to 80% of bacteria, dsRed2 was expressed in ˜ 100% of bacterial populations. Bacteria- dsRed2 could then be accurately quantified by flow cytometry after adjusting the threshold of PE (phycoerythrin) and PMT voltage (photomultiplier tube) of FSC (forward scatter) to reduce equipment oscillation and the rate of abort events, with low false discovery rate (FDR) and coefficients of variations between replicates. With the new methodology, quantifications by CFU and flow cytometry were equivalent for M.tb, but significantly different in the other evaluated species, indicating that the solid medium is not able to support the adequate growth of non-M.tb species . Then, using the new bacterial quantification protocol, we compared the infection rates and phagocytosis rates in THP-1 macrophages infected with MTBC and M. canettii using different multiplicities of infection (MOIs of 2:1, 5:1, 10:1 and 20:1). Both indices behaved in a dose-dependent manner for all species, except for M. caprae, which presented similar indices in all MOIs, at levels that were only obtained in higher MOIs (10:1 and 20:1) by other MTBC species. Additionally, M. canettii indices significantly outperformed the MTBC species in all MOIs. To explain this finding, we sequenced the complete genome of M. canettii and showed that the tested strain lost one pks5 gene copie (polyketide synthase 5) responsible for the synthesis of lipooligosaccharides. Spontaneous loss of this gene has been associated with greater infectivity of M. canettii in macrophages, explaining the findings. Finally, the levels of cell death evaluated during 96h indicate that M. bovis and M. caprae induce higher levels of apoptosis 24h p.i. in THP-1 macrophages. As the infection progresses, necrosis levels increase, however M. caprae outperformed all species at 72h and 96h of infection. In conclusion, this is a comparative study between MTBC species that brings important methodological contributions and to the understanding of macrophage infection by MTBC species and M. canettii.