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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.10.2006.tde-02032007-152655
Document
Author
Full name
Renata Molina Monteiro
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2006
Supervisor
Committee
Soares, Rodrigo Martins (President)
Gennari, Solange Maria
Silva, Aristeu Vieira da
Title in Portuguese
Caracterização de protozoários pertencentes à sub-família Toxoplasmatinae pela análise molecular do gene codificador de proteína do choque térmico (HSP70) e do espaçador interno transcrito 1 (ITS-1)
Keywords in Portuguese
diagnóstico
fezes
reação em cadeia pela polimerase
Abstract in Portuguese
Os membros da sub-famíla Toxoplasmatinae conhecidos são Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora hughesi, Neospora caninum e Hammondia heydorni. As duas primeiras espécies têm os felídeos como hospedeiro definitivo, enquanto as duas últimas têm desenvolvimento sexual em carnívoros da família dos canídeos. O ciclo biológico de N. hughesi é pouco conhecido. Foi estudado a variabilidade nucleotídica de seqüências intercaladas entre os genes codificadores das frações ribossômicas 18S, 5.8S (ITS-1). No entanto, como estas não permitem reconstruções filogenéticas com o uso de grupo externo, em virtude da inconsistência dos alinhamentos produzidos, pesquisamos uma seqüência codificadora de proteína sendo o marcador escolhido, o gene codificador da proteína de choque térmico HSP70 (heat shock protein 70KDa). Este gene é bastante utilizado para resolução de filogenias de outros organismos como, por exemplo, aqueles pertencentes ao gênero Cryptosporidium. No presente trabalho, amplificamos por PCR e seqüenciamos 951 pares de bases (pb) do gene codificador de HSP70 de oocistos T. gondii-like (oriundos de fezes gatos), de oocistos Neospora-like (de fezes de cães) e de taquizoitos de N. caninum, N. hughesi e T. gondii mantidos em laboratório. Os primers foram desenhados a partir de seqüências consenso obtidas em pesquisa de bancos de dados de seqüências EST de N. caninum e seqüências de RNAm de T. gondii. Seqüências ITS-1 destes oocistos também foram determinadas para a confirmação da espécie de parasito estudada. Os resultados mostram que os táxons H. hammondi e T. gondii são monofiléticos e geneticamente muito próximos, mas contrariando resultados anteriores, não foi demonstrada a monofilia entre os táxons H. heydorni e N. caninum. De fato, a análise de diversidade nucleotídica de gene codificador HSP70 mostra que a distância evolutiva entre H. heydorni e N. caninum é tão grande quanto a distância de cada uma destas espécies com T. gondii. Em adição, foi possível identificar dentre as amostras de oocistos, duas linhagens divergentes de H. heydorni. Paralelamente ao estudo filogenético também foi possível desenvolver um método diagnostico diferencial para oocistos tipo Hammondia. As seqüências de gene HSP70 obtidas foram alinhadas e dois pares de primers internos a estas seqüências foram desenhados. O primeiro par amplifica 771 pb de oocistos T. gondii-like e o segundo 400 pb de oocistos Neospora-like. A clivagem do fragmento de 771 pb com enzima de restrição Hin6I produz perfis eletroforéticos distintos para amostras de T. gondii e H. hammondi. A clivagem do fragmento de 400pb com a enzima de restrição MunI também produz perfis eletroforéticos distintos entre amostras de N. caninum e H. heydornii. A diferenciação dos perfis de restrição pode ser feita em eletroforese em gel de agarose a 2,5%.
Title in English
Characterization of protozoan belonging to sub-family Toxoplasmatinae through the molecular analysis from of heat shock protein (HSP70) coding gene and internal transcript spacer 1 (ITS-1)
Keywords in English
diagnostic
feaces
polymerase chain reaction
Abstract in English
Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora huguesi, Neospora caninum and Hammondia heydorni are the known members of the sub-family Toxoplasmatinae. H. heydorni and N. caninum use canids as definitive hosts whereas felids are the definitive hosts from T. gondii and H. hammondi. The definitive host of N. hughesi is unknown. Here, the nucleotide diversity at internal transcribed spacer (ITS-1) and heat shock protein (HSP70 kDa) loci in the subfamily toxoplasmatinae were studied. The HSP70 coding genes are widely used for phylogenetic studies in a number of other organisms specially within the genus Cryptosporidium. In the present study, it was amplified by PCR and sequenced 951 bases pairs (bp) from HSP70 coding gene from oocysts T.gondii-like (from cat), from oocysts N. caninum-like (from dog) and tachyzoites of N. hughesi grown on cell cultures. The primers were designed based on consensus sequences within EST sequences of N. caninum sequences and RNAm sequences of T. gondii. ITS-1 sequences amplified from oocysts were also obtained in order to confirm the species of the parasites. The results showed that T. gondii and H. hammondi are monophyletic and genetically very close, but the monophyletic status of H. heydorni N. caninum was not demonstrated. In fact, the nucleotide diversity at the HSP70 locus has shown that the evolutionary distance between H. heydorni and N. caninum is as high as that observed between either H. heydorni or N. caninum and T. gondii., In addition, it was possible to identify two distinct groups among the H. heydorni oocysts. Concomitantly to the phylogenetic study it was also possible to standardize a diagnostic test capable of differentiate the oocysts Hammondia-like was development a diagnostic method that differ oocysts T. gondii-like and N. caninum-like. The sequences obtained from HSP70 coding gene were aligned and two new pair of PCR primers was designed. The first pair amplifies 771bp from T. gondii-like oocysts, whereas the second pair amplifies 400 bp from N. caninum-like oocysts. The restriction enzyme Hin6I used to cleave the 771 bp amplicons generated distinct profiles with samples from H. hammondi and T. gondii. The same occurred with the restriction of the fragments of 400bp cleaved by the enzyme MunI used in N. caninum e H. heydorni samples. The profiles can be differentiated by 2.5% agarose gel electrophoresis.
 
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RenataMolinaMonteiro.pdf (836.72 Kbytes)
Publishing Date
2007-03-07
 
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