O câncer figura como uma relevante causa de morte em humanos e pequenos animais. Uma das neoplasias mais desafiadoras em ambas as situações é o melanoma, com um comportamento agressivo e alto índice de metástases. As similaridades existentes entre as neoplasias malignas em ambas as espécies despertam o interesse no uso de cães como modelos para estudos oncológicos em humanos. Atualmente, a medicina tem focado na medicina de precisão e, dentro dela, na biópsia líquida. Esta é uma ferramenta inovadora que detecta biomarcadores tumorais, incluindo células tumorais circulantes (CTCs). Ela apresenta potencial para prognóstico, diagnóstico e avaliação do tratamento. Apesar do grande interesse em oncologia humana, estudos de biópsia líquida são escassos em veterinária e focam mais em outros marcadores. Baseando-se nisso, o objetivo dessa tese foi aplicar dois métodos de detecção de CTCs em cães com melanoma oral. No primeiro capítulo, foi feita uma revisão bibliográfica dos temas “melanoma em cães” e “biópsia líquida ”. No segundo capítulo, foi testada a metodologia de enriquecimento por centrifugação por gradiente de densidade e de caracterização por PCR transcriptase-reversa em tempo real para os transcritos melan-A e tirosinase. O grupo de estudo analisado foi de 31 pacientes. Um estudo-piloto demonstrou boa sensibilidade da técnica, e 29/31 pacientes (93%) apresentaram resultados positivos, porém, os controles apontaram 43% de falsos-positivos. A eletroforese em gel de agarose sugeriu amplificações inespecíficas. Muitas dificuldades inerentes à técnica e particularidades da realidade veterinária podem ter contribuído para o resultado observado, e essa experiência é discutida em mais detalhes. No terceiro capítulo, foi testada a metodologia de microfiltração pelo método Isolation by Size of Tumor Cells (ISET), seguida pela caracterização imunocitoquímica com os marcadores melan-A, PNL2 e S100. O grupo de estudo analisado foi de 10 pacientes. CTCs foram encontradas e caracterizadas em 9/10 casos. A média de CTCs encontradas foi de 1,1 célula/mL de sangue. 3/10 casos foram positivos para melan-A, 3/10 para PNL2 e 8/10 para S100, demonstrando a heterogeneidade das CTCs. No entanto, amostras de neoplasias não melanocíticas também marcaram para S100, apontando baixa especificidade deste marcador. Um paciente com progressão tumoral rápida apresentou 18 células isoladas e microêmbolos tumorais, porém um paciente sem CTCs detectadas teve progressão similar, logo a ausência de CTCs não pode ser sempre correlacionada a um prognóstico melhor. A avaliação estatística demonstrou correlação significativa entre o número de CTCs e a presença de metástases linfonodais, sugerindo uma potencial capacidade de avaliação prognóstica. Conclui-se que metodologias já estabelecidas em humanos, mediante as devidas adaptações, permitem a detecção de CTCs em pacientes caninos com melanoma oral. A ISET apresentou uma boa capacidade de detectar as CTCs, e seus resultados demonstram uma possível aplicação para avaliação prognóstica do paciente. Ensaios clínicos em larga escala são desejados para que comprovar a sua utilidade clínica e para que tanto os cães quanto os humanos possam se beneficiar mais dessa técnica.

Cancer is a relevant cause of death among humans and companion animals. In both cases, melanoma is a challenging diagnosis, with highly aggressive behavior and a high risk of metastasis. Similarities between malignant neoplasms in these species motivate the use of dogs as models for medical oncology studies. Nowadays, there is a focus on personalized medicine and, consequently, on liquid biopsy. This novel tool detects tumoral biomarkers, including circulating tumor cells (CTCs). It has the potential for patients prognostic, diagnostic, and therapeutic assessment. Besides its considerable interest in human oncology, liquid biopsy studies are still lacking in veterinary medicine and tend to focus on other biomarkers. Based on this, this thesis aims to apply two CTC detection methods in dogs with oral melanoma. In the first chapter, a bibliographic review was conducted on the subjects “canine melanoma” and “ liquid biopsy”. In the second chapter, we tested the enrichment of cells by density- gradient centrifugation and characterization by real-time reverse-transcriptase PCR for melan-A and tyrosinase transcripts. There were 31 dogs enrolled in this study. A pilot study has shown good sensitivity to this technique, and 29/31 patients (93%) had positive results. However, controls have shown a 43% false-positive rate. Agarose gel electrophoresis results suggested unspecific amplification. Many challenges inherent to the technique and particularities inherent to veterinary reality may have contributed to these results, and this experience is further discussed. In the third chapter, we tested the enrichment of cells by microfiltration, specifically Isolation by Size of Tumor Cells (ISET), followed by characterization with immunocytochemistry for melan-A, PNL2 and S100 markers. There were 10 dogs enrolled in this study. CTCs were detected and stained positive in 9/10 samples. The mean count of CTCs was 1,1 cells/mL of blood. 3/10 samples were positive for melan-A, 3/10 for PNL2, and 8/10 for S100, showing how heterogeneous these cells are. However, samples from non-melanocytic neoplasms were also stained for S100, showing this markers low specificity. A patient with fast tumoral progression had 18 total individual cells and tumoral microemboli. However, a patient with no detected CTCs had a similar progression. Thus, the absence of CTCs can not always be correlated with a better prognosis. Statistical analysis has shown a significant correlation between CTC count and lymph node metastasis, suggesting a potential capacity in prognosis assessment. We conclude that, with its adaptations, well-established methods in human medicine allow the detection of CTC in dogs with oral melanoma. ISET demonstrated a good performance in detecting CTCs and it also has shown a potential application in patient prognosis assessment. Large-scale clinical trials are needed to validate its clinical utilities, and dogs and humans may benefit more from these techniques.