Uma das doenças mais antigas e avassaladoras que ainda se tem atualmente é a raiva. Essa doença é causada por um vírus (RABV) do gênero Lyssavirus que acomete o sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. Portanto, é uma infecção que causa manifestações neurológicas e que, quando esses sintomas se apresentam, quase 100% dos casos chegam ao óbito. Por conseguinte, essa doença requer que seu diagnóstico seja ágil e o mais confiável possível. A Organização Mundial da Saúde (OMS) indica a técnica de imunofluorescência direta (IFD) como o teste padrão ouro para o diagnóstico da raiva post-mortem. Essa técnica é rápida e possui resultados acurados, visto que ela possui alta sensibilidade e especificidade. Contudo, alguns fatores podem reduzir sua sensibilidade tais como: amostra degradada, baixa qualidade do anticorpo e do microscópio utilizados, e a experiência do laboratorista. Diante disso, é recomendado que se faça um teste confirmatório. Por muitos anos, testes como isolamento viral (em camundongo e em cultivo celular) e RT-PCR foram utilizados como testes confirmatórios à IFD. Recentemente, a OMS apresentou uma nova técnica de RT-qPCR para o confirmar o diagnóstico da raiva, o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus em um teste singleplex. Nos estudos realizados, o LN34 tem apresentado alta sensibilidade e especificidade diagnósticas, porém há poucas investigações em amostras brasileiras que, por natureza, possuem sequências genéticas distintas do RABV. Além disso, técnicas moleculares tendem a ser mais dispendiosas, o que restringiria o acesso a esse tipo de diagnóstico. Uma opção para reduzir os custos do LN34 é utilizar RT-qPCR no formato multiplex ao invés do singleplex. Dessa forma, o presente trabalho teve o objetivo de comparar o desempenho da IFD e da LN34 nos modos singleplex e multiplex. No primeiro experimento, o ensaio LN34 singleplex foi testado utilizando 332 amostras de animais (170 IFD positivas) oriundas do estado de São Paulo. O ensaio LN34 singleplex demonstrou alta sensibilidade (100%) e especificidade (96,7%) diagnósticas em comparação com o teste de IFD, e todas as amostras IFD positivas tiverem resultados concordantes com o do ensaio LN34 singleplex. No segundo experimento, LN34 multiplex foi feito em paralelo com LN34 singleplex usando 211 amostras de animais de SNC (102 IFD positivos) procedentes de diferentes municípios do estado de São Paulo. O ensaio LN34 multiplex apresentou alta sensibilidade (93,4%) e alta especificidade (100%), enquanto o ensaio LN34 singleplex apresentou sensibilidade e especificidade diagnósticas de 100% e 95,3%, respectivamente. Conclui-se que o LN34 singleplex possui grande potencial para ser usado como teste confirmatório para diagnosticar raiva e, embora tenha resultados semelhantes, o LN34 multiplex ainda possui sensibilidade diagnóstico menor que o singleplex.

One of the oldest and devastating disease that are still present nowadays is rabies. This disease is caused by a virus (RABV) from the Lyssavirus genus that affect the central nervous system (CNS) of mammals. Therefore, it is an infection giving neurological manifestations and, once they start showing, almost 100% of the infected will likely die. For this reason, this disease requires a rapid and reliable diagnosis. The World Health Organization (WHO) indicates the direct fluorescent antibody test (dFAT) as the gold standard test for post-mortem rabies diagnosis. This technique is fast and has accurate results, since it has high diagnostic sensitivity and specificity. On the other hand, some factors may reduce its sensitivity such as: degraded samples, low quality of antibody and microscope used, and the technician experience. Hence the need for a confirmatory test. For many years, tests such as mouse inoculation test (MIT), rabies tissue culture infection test (RTCIT) and RT-PCR were used as dFAT confirmatory tests. Recently, the WHO introduced a new RT-qPCR technique for rabies diagnosis, the LN34 Pan-Lyssavirus assay in a singleplex test. In the studies, the LN34 has shown high diagnostic sensitivity and specificity, but there are only a few investigations in Brazilian samples, which naturally have peculiar genetic sequences of RABV. In addition, molecular techniques are usually more expensive, which might limit the access to rabies diagnosis. A possible solution for this situation could be to perform a RT-qPCR multiplex instead of the singleplex in the LN34 assay. Thus, the present study aimed to compare the dFAT, the LN34 singlepex and the LN34 multiplex laboratorial performance. In the first experiment, the LN34 singleplex assay was tested using 332 animal samples (170 dFAT positive) from Sao Paulo state. The LN34 singleplex assay demonstrated high diagnostic sensitivity (100%) and specificity (96.7%) in comparison to the dFAT, and all dFAT samples positive were concordant with the LN34 singleplex assay. In the second experiment, LN34 multiplex was done in parallel with LN34 singleplex using 211 brain animal samples (102 dFAT positive) from different municipalities in Sao Paulo state. LN34 multiplex assay provided high sensitivity (93.4%) and high specificity (100%) while LN34 singleplex assay presented diagnostic sensitivity and specificity of 100% and 95.3%, respectively. In conclusion, the LN34 singleplex has great potential to be used as the dFAT confirmatory test and, although it showed similar results, the LN34 multiplex still has lower diagnostic sensitivity than the LN34 singleplex.