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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.10.2022.tde-01122022-112250
Document
Auteur
Nom complet
Mariana de Souza Aranha Garcia Gomes
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2022
Directeur
Jury
Mori, Claudia Madalena Cabrera (Président)
Alonso, Orfa Yineth Galvis
Gil, Cristiane Damas
Peron, Jean Pierre Schatzmann
Porcionatto, Marimelia Aparecida
Titre en portugais
Caracterização do camundongo mutante audiogênico tremor como novo modelo de epilepsia: estudo de neurotransmissores e citocinas pró-inflamatórias no hipocampo
Mots-clés en portugais
Camundongo tremor
Citocinas pró-inflamatórias
Fenótipo comportamental
Neuroinflamação
Neurotransmissores
Resumé en portugais
O camundongo mutante espontâneo tremor (tr) foi identificado no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. A mutação foi assim denominada pois a primeira característica fenotípica aparente dos animais foi o tremor ao se movimentarem. A mutação, autossômica recessiva, foi inicialmente observada em camundongos Swiss, e mais tarde, por meio de dez retrocruzamentos, foi transferida para a linhagem congênica C57BL/6 (N10), pois isso possibilitaria o mapeamento genético para encontrar a mutação. Além do tremor a característica mais marcante desses mutantes foi a presença de convulsões clônicas de origem audiogênica, crises reflexas que se encaixam no diagnóstico de epilepsia, fazendo com que esses camundongos sejam considerados um novo modelo animal para o estudo desta disfunção. Para aprimorar a caracterização do mutante tremor foram estudadas suas respostas em testes comportamentais e o seu desenvolvimento pós-natal físico e de reflexos. Com os resultados do desenvolvimento pós-natal identificou-se que os mutantes tremor apresentaram alterações, como incoordenação motora e diminuição das respostas similares as de ansiedade, somente após o desmame, ou seja na terceira semana de vida. Resultados preliminares do mapeamento genético utilizando marcadores microssatélites distribuídos pelo genoma do camundongo, indicaram que a mutação se encontraria no cromossomo 14, na região entre 33,21 e 38,21cM, tendo como gene candidato mais provável o Egr3; entretanto, o sequenciamento realizado pelo método Sanger não apresentou alterações quando comparado aos camundongos controle (Wild Type WT). Para a caracterização das crises epilépticas os camundongos foram expostos à estímulo acústico com frequência de 20kHz, apresentando convulsão audiogênica clônica generalizada. Trinta minutos após a convulsão a expressão de RNA mensageiro (mRNA) do gene candidato Egr3 e dos genes Gabra1 e Gabra 4, descritos na literatura como relacionados ao surgimento e ao desenvolvimento de convulsões, foi quantificada no hipocampo por qRT-PCR. Foi quantificada também a expressão das citocinas pró-inflamatórias Tnf-α, Il-1β, Il-6, Ccl2 e Ccl3. Os neurotransmissores, e seus metabólitos, que são considerados importantes para o desenvolvimento e controle das crises epilépticas foram quantificados por HPLC, sendo eles: ácido γ-amino butírico (GABA), glutamato (GLU), glicina (GLY), aspartato (ASP), dopamina (DA), ácido 3,4-di-hidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanilico (HVA), noradrenalina (NOR) ácido vanilmandélico (VMA), serotonina (5-HT) e ácido 5 hidroxi indol acético (5HIAA). Quando comparados aos camundongos WT os mutantestremor apresentaram aumento na concentração de GABA, GLU, ASP, NOR e neurotransmissores da via serotoninérgica e diminuição dos níveis de HVA e de GLY no hipocampo. Em relação à expressão gênica, observou-se superexpressão de ll-1β e Ccl3 no hipocampo dos camundongos tremor naive, com diminuição significativa 30 minutos após a convulsão. Ao contrário, a expressão de Gabra1 e Gabra4 que se encontrava diminuída no hipocampo dos camundongos tremor naive, aumentou após a convulsão. Esses resultados indicaram que os genes Egr3, Gabra 1 e 4 e as citocinas ll-1β e Ccl3 estão envolvidos no mecanismo de surgimento e desenvolvimentos das convulsões no mutante tremor, que pode ser caracterizado como um novo modelo animal para estudo de epilepsia.
Titre en anglais
Characterization of the audiogenic mutant mice tremor as a new model of epilepsy: evaluation of neurotransmitters and proinflammatory citokynes in hippocampus
Mots-clés en anglais
Tremor mice
Behavioral Phenotype
Neuroinflammation
Neurotransmitters
Proinflammatory cytokines
Resumé en anglais
The spontaneous mutant mice tremor (tr) was identified in the animal facility of the Department of Pathology from Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade de São Paulo. The mutation was named tremor because the first phenotypic characteristic seen in these mice was the tremor when moving. This autossomal recessive mutation was firstly observed in Swiss mice, and then transferred to C57BL/6 by ten backcrosses (N10), as this would allow genetic mapping to find the mutation. Besides tremor, the most important characteristic of this mutant is the presence of audiogenic tonic seizures, that are reflex seizures that fits the epilepsy diagnostic, making these mice a new animal model to study or this disease. To improve behavioral characterization of mutant tremor, their results in behavior tests were analyzed along their postnatal physical and reflexology development. Postnatal development analysis made possible to identify that mutant tremor presents changes, such as motor impairment and decreased anxiety-like responses, only after third week of life, at the weaning. Primary results of genetic mapping using microsatellite markers distributed by the mouse genome, indicated that the mutation is in chromosome 14 (between 33.21 and 38.21cM), making Egr3 an important candidate gene, even though the sequencing performed by Sanger method of tremor sample did not show differences when compared to wild type (WT) mice. Regarding the characterization of epileptic seizures mice were exposed to a sound stimulus at a frequency of 20kHz, presenting audiogenic clonic seizures. Thirty minutes after seizure the expression of mRNA of candidate gene (Egr3) and other important genes (Gabra1 and 4), known in literature to be important in epileptogenesis, were quantified in hippocampus by real time PCR (qRT-PCR). Proinflammatory cytokines (Tnf-α, Il-1β, Il-6, Ccl2 e Ccl3) expression. were quantified. Neurotransmitters, and it metabolites, that are also considered important for epileptogenesis and it epilepsy control were quantified by HPLC, such as γ- amino butyric acid (GABA), glutamate (GLU), glycine (GLY), aspartate (ASP), dopamine (DA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), homovanillic acid (HVA), noradrenalin (NOR), vanilliylmandelic acid (VMA), serotonin (5-HT) and 5- Hydroxyindoleacetic acid (5HIAA). Comparing to WT mice, tremor presented raised levels of GABA, GLU, ASP, NOR and neurotransmitters of seroroninergic pathways, and decrased levels HVA and GLY in hippocampus. Considering gene expression, an overexpression of ll-1β and Ccl3 was observed in hippocampus of naive mice, and a significant decrease thirdy minutes after seizures. On the other hand, decreased expression of Gabra 1 and 4 found in hippocampus of naive mice raised after seizure. These results showed that genes Egr3, Gabra 1 and 4 and cytokines ll- 1β and Ccl3 are involved in epileptogenesis of mutant tremor, which can be characterized as a new model to study epilepsy.
 
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Date de Publication
2023-01-02
 
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