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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.10.2021.tde-24062021-100651
Documento
Autor
Nome completo
Cecilia Benazzato
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Braga, Patricia Cristina Baleeiro Beltrao (Presidente)
Bressan, Fabiana Fernandes
Iwashe, Elisa Mitiko Kawamoto
Marchetto, Maria Carolina Nasser
Pignatari, Graciela Conceição
Título em português
Modelagem celular de bebês nascidos com microcefalia causada por infecção vertical por Zika Vírus
Palavras-chave em português
iPSC
Microcefalia
Modelagem de doenças
SNC
Zika Vírus
Resumo em português
Em 2015, um número incomum de casos de bebês nascidos com microcefalia no Nordeste do Brasil chamou atenção, especialmente por apontarem um arbovírus, o Zika vírus (ZIKV), como possível causador de uma infecção congênita. O ZIKV é um Flavivírus transmitido pelo mosquito Aedes aegypti e cuja infecção produz efeitos brandos em humanos, com raras manifestações neurológicas e ocasionalmente síndrome de Guillain-Barré. Entretanto, em função de esclarecer os casos de microcefalia, estudos foram realizados comprovando que o ZIKV era capaz de infectar células do Sistema Nervoso Central (SNC), como neurônios e células da glia e, em especial, células mais imaturas, como as progenitoras neurais (NPC), abundantes no feto. Quando as NPC são infectadas pelo ZIKV, há menos migração celular, comprometimento da neurogênese e morte celular por apoptose, o que provavelmente acaba contribuindo para a microcefalia em recém-nascidos. O intuito desse projeto foi o de modelar in vitro o SNC de pacientes que nasceram com microcefalia congênita causada pela infecção vertical por ZIKV. Nosso objetivo foi verificar os efeitos celulares e moleculares da ação do vírus nestes pacientes durante a formação do SNC sob a hipótese de que a infecção maternal tenha induzido modificações celulares e moleculares que sejam responsáveis pelo fenótipo patogênico apresentado na síndrome congênita do Zika vírus (CZS). Nossos resultados mostraram que os fibroblastos utilizados para a reprogramação e estudo desses pacientes in vitro foi uma ótima alternativa mediante a dificuldade de obtenção de amostras. Além disso, as iPSC geradas através da reprogramação via transfecção de plasmídeos epissomais nos fibroblastos foram diferenciadas em astrócitos e neurônios. De acordo com a porcentagem de células diferenciadas, os pacientes foram divididos em dois grupos: um com 20% de astrócitos na cultura mista de neurônios (CZS-A), semelhante ao grupo controle, e outro grupo que apresentou baixa expressão de marcadores de astrócitos (CZS-B). A investigação da quantidade de sinapses nos neurônios derivados das iPSC dos pacientes com a CZS apresentavam menor expressão nas proteínas pré e pós-sinápticas (em ambos os grupos), assim como na sua colocalização, indicando que esses pacientes apresentam uma redução significativa de sinapses comparado ao grupo controle. Entretanto, foi observado uma redução significativa de proteína pós-sináptica e sua colocalização com a proteína pré- sináptica ao comparar os dois grupos de neurônios, sendo menor em pacientes CZS- B. Um quadro de redução significativa na produção de glutamato também foi observado nos astrócitos dos pacientes com CZS em comparação ao grupo controle, porém a curva de recaptação de glutamato apresentou o mesmo padrão de recaptação em ambos os grupos. Com esse trabalho e os resultados obtidos, podemos dizer que é possível modelar a CZS in vitro focando nos fenótipos celulares e moleculares, porém mais estudos serão necessários para confirmar esses achados e eventualmente correlacioná-los com as características clínicas encontradas nestas crianças.
Título em inglês
Cellular modeling of babies born with microcephaly caused by vertical infection by Zika Virus
Palavras-chave em inglês
CNS
Disease modeling
iPSC
Microcephaly
Zika Virus
Resumo em inglês
In 2015, an unusual number of cases of babies born with microcephaly in Northeastern Brazil drew attention, especially for pointing out an arbovirus, the Zika virus (ZIKV), as a possible cause of congenital infection. ZIKV is a flavivirus transmitted by the Aedes aegypti mosquito and whose infection produces mild effects in humans, with rare neurological manifestations and occasionally Guillain-Barré syndrome. However, to clarify the microcephaly cases, studies have been carried out proving that ZIKV was able to infect cells of the Central Nervous System (CNS), such as neurons and glial cells and, in particular, more immature cells, such as neural progenitors. (NPC), abundant in the fetus. When NPCs are infected with ZIKV, there is less cell migration, impaired neurogenesis, and cell death from apoptosis, which probably contributes to microcephaly in newborns. The aim of this project was to model in vitro the CNS of patients who were born with congenital microcephaly caused by vertical ZIKV infection. Our objective was to verify the cellular and molecular effects of the virus action in these patients during the CNS formation under the hypothesis that maternal infection has induced cellular and molecular changes responsible for the pathogenic phenotype presented in the congenital Zika virus syndrome (CZS). Our results showed that the fibroblasts used for reprogramming and studying these patients in vitro were a great alternative due to the difficulty of obtaining samples. Also, iPSCs generated by reprogramming via transfection of episomal plasmids in fibroblasts were differentiated into astrocytes and neurons. According to the percentage of differentiated cells, patients were divided into two groups: one with 20% of astrocytes in the mixed neuron culture (CZS-A), similar to the control group, and another group that presented low expression of astrocyte markers. (CZS-B). The investigation of the number of synapses in the iPSC-derived neurons of patients with CZS showed less expression in pre-and postsynaptic proteins (in both groups), as well as in their colocalization, indicating that these patients have a significant reduction in synapses compared to the control group. However, a significant reduction in postsynaptic protein and its colocalization with presynaptic protein was observed when comparing the two groups of neurons, lower CZS-B patients. A picture of a significant reduction in glutamate production was also observed in the astrocytes of patients with CZS compared to the control group. Still, the glutamate reuptake curve showed the same reuptake pattern in both groups. With this work and the results obtained, we can say that it is possible to model CZS in vitro, focusing on cellular and molecular phenotypes. However, more studies will be needed to confirm these findings and eventually correlate them with the clinical characteristics found in these children.
 
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Data de Publicação
2021-07-26
 
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