• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.10.2017.tde-24012017-081720
Documento
Autor
Nombre completo
Frederico Guilherme Freitas Lobão Rodrigues Gomes
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2016
Director
Tribunal
Assís Neto, Antônio Chaves de (Presidente)
Farias, Edison Luiz Prisco
Miretti, Marcos Mateo
Título en portugués
Geração de vetor lentiviral sintético para terapia genética ex vivo
Palabras clave en portugués
Biologia sintética
Lentivírus
Proteína terapêutica
Terapia gênica
Resumen en portugués
A terapia gênica consiste em introduzir uma sequência de nucleotídeos, codificante ou não-codificante, que tenha a capacidade de interferir na progressão de uma doença por ativação, inativação ou modulação da expressão de um gene alvo. Uma das rotas de transferência gênica é a ex vivo. Essa rota consiste em realizar a modificação gênica ex vivo de um tipo celular do organismo afetado, seguida do transplante celular no indivíduo para a correção do fenótipo. Dentre os vários vetores virais utilizados para transferência gênica, o sistema lentiviral é considerado um dos mais eficazes, visto que é capaz de manter altos níveis de expressão a longo prazo. Além disso, dentre os vetores virais que se integram no genoma, esse é considerado o mais seguro, tendo apresentado apenas um caso com relatado de efeito colateral sem reação adversa. Uma nova tecnologia utilizada para padronizar sistemas biológicos é a biologia sintética. Essa tecnologia pode ser utilizada como ferramenta para produzir e/ou otimizar sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse terapêutico. O objetivo desse trabalho é gerar um vetor lentiviral sintético, para terapia gênica ex vivo, para reposição enzimática. Foram geradas quatro linhagens celulares humanas com produção transiente das proteínas terapêuticas Prot_Ctr e Prot_Mut sob controle dos promotores CMV e HeF1a. Para padronização do ensaio de transfecção, foram geradas duas linhagens celulares humanas que expressão da proteína fluorescente verde (GFP) sob controle dos mesmos promotores citados acima. Como controle negativo das linhagens produtoras da proteína terapêutica, foi gerada uma linhagem como vetor plasmidial vazio pLV_GTW_Mock. O nível de expressão do mRNA relativo às proteínas terapêuticas variou de 3.581,95 ± 1.322 a 10.377,18 ± 2.562 URE, não havendo diferenças significativas entre as linhagens produzidas (p > 0,05). O nível de produção da proteínas terapêuticas variou de 30,98 UI/mL a 241,1 UI/mL. A linhagem com maior produção dessa proteína foi a 293T/HeF1a_Prot_Mut, e essa diferença é significativa (p < 0,05). A partir da transfecção dos plasmídeos auxiliares e plasmídeo portador do cDNA que codifica a Prot-Mut na linhagem celular 293-T foi obtido o vetor lentiviral com título de 1,68x107 pLV/mL. Em conclusão, é possível gerar um vetor lentiviral funcional portador da Prot_Mut para utilização em terapia gênica ex vivo. Espera-se que o produto desse projeto de pesquisa gere uma patente. Para evitar a quebra de novidade, atividade inventiva e suficiência descritiva, requisitos mínimos de patenteabilidade, os resultados foram apresentados sem mencionar a doença e o gene em estudo
Título en inglés
Generation of synthetic lentiviral vector for ex vivo gene therapy
Palabras clave en inglés
Gene therapy
Lentivírus
Synthetic biology
Therapeutic protein
Resumen en inglés
Gene therapy involves introducing a nucleotide sequence, coding or non-coding that can to interfere with the progression of a disease by activating, inactivating or modulating the expression of a target gene. One of the gene transfer routes is the ex vivo. This route consists in producing a ex vivo gene modification of a cellular kind of the affected organismo, following the transplant of those cells to correct the fenotype. Among the various viral vectors used for gene transfer, the lentiviral system is considered one of the most effective, since it is able to maintain high levels of long-term expression. Between the viral vectors that integrate into the genome, the lentiviral system is considered the safest, and It has only filed a case with reported side effect without adverse reaction. A new technology used to standardize biological systems is the synthetic biology. This technology can be used as a tool to produce and/or optimize expression systems for production of proteins of therapeutic interest. The aim of this study is to generate a synthetic lentiviral vector for ex vivo gene therapy, for enzyme replacement therapy. It were generated four human cell lines with transient production of therapeutic proteins Prot_Ctr and Prot_Mut under the control of CMV and HeF1a promoters. To standardize the transfection assay were generated two human cell lines expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the same promoters cited above. As a negative control of the producing cell lines, It was generated a human cell line with an empty plasmid vector pLV_GTW_Mock. The level of mRNA expression relative to the therapeutic proteins ranged from 3581,95 ± 1322 to 10377,18 ± 2562 REU, there were no significant differences among the produced cell lines ( p > 0.05 ). The production level of therapeutic proteins ranged from 30.98 IU/mL to 241.1 IU/mL. The cell line with the highest production of the therapeutic protein was 93T/HeF1a_Prot_Mut+, and this difference is significant (p < 0.05 ). From the transfection of the plasmid containing the cDNA encoding the Prot_Mut and packing plasmid It was obtained lentiviral vector with the titer 1,68x107 pLV/mL. In conclusion, it is possible to generate a functional lentiviral vector carrying the Prot_Mut for use in ex vivo gene therapy. It is expected that the product of this research project generates a patent. To avoid breaking novelty, inventive activity and descriptive sufficiency, minimum requirements for patentability, the results were presented without mentioning the disease and the gene under study
 
ADVERTENCIA - La consulta de este documento queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso:
Este documento es únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro. Esta reserva de derechos afecta tanto los datos del documento como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes del documento es obligado indicar el nombre de la persona autora.
Fecha de Liberación
2021-03-16
Fecha de Publicación
2017-05-23
 
ADVERTENCIA: Aprenda que son los trabajos derivados haciendo clic aquí.
Todos los derechos de la tesis/disertación pertenecen a los autores
CeTI-SC/STI
Biblioteca Digital de Tesis y Disertaciones de la USP. Copyright © 2001-2022. Todos los derechos reservados.