Em ruminantes, o reconhecimento materno da prenhez (MRP) envolve a produção de interferon tau (IFNT) pelas células do trofectoderma (TE) do embrião para prevenir a luteólise. Apesar da sinalização IFNT ser caracterizada, a produção e liberação de vesículas extracelulares (VEs) surgiu como um potencial mecanismo de comunicação celular entre a mãe e o embrião durante a MRP. A hipótese deste projeto é que as células do endométrio e do TE cultivadas in vitro podem produzir e liberar VEs, que podem ser internalizadas e modulam o transcriptoma nas células-alvo. Para testar essa hipótese, geramos culturas de células endometriais (origem epitelial e estromal) e de células do TE de blastocistos FIV e isolamos as VEs dos meios de cultura. As linhagens de células epiteliais e estromais (n = 5) foram isoladas, mantidas até a 4ª passagem e, posteriormente, caracterizadas por imunofluorescência (anti-citoqueratina, células epiteliais e anti-vimentina, células estromais). As células do TE dos embriões FIV foram cultivadas até a 2ª passagem e caracterizada por imunofluorescência (anti-CDX2). As VEs isolados foram avaliadas quanto ao tamanho e a concentração de partículas usando Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Em relação a caracterização das células endometriais observamos que apenas células epiteliais foram positivas para citoqueratina e as células estromais foram positivas para vimentina, como esperado. As células do TE foram positivas para CDX2. As VEs mostraram um tamanho médio de 131,92 ± 5,52, 153,46 ± 7 e 143,66 ± 4,60 e concentração 6,54E+08 ± 4,57E+07, 8,15E+08 ± 4,59E+07 e 2,56E+11 ± 1,61E+10 partículas/mL, para células epiteliais, estromais e do TE, respectivamente. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre os grupos estudados. A caracterização das VEs por Western blotting confirmou a presença de ALIX e a ausência da proteína GRP78 nas VEs. Além disso, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostrou que as VEs possuem morfologia e tamanho esperado (<150nm). Para simular o “crosstalk” materno-embrionário in vitro e investigar como as VEs modulam os transcritos nas células alvo, realizamos o tratamento das células endometriais com VEs do TE e vice e versa, o tratamento das células da TE com VEs das células endometriais. Após 6 horas de tratamento, o RNAseq revelou que as VEs da linhagem do TE dos embriões alteraram de maneira mais ampla o perfil transcricional das células estromais em comparação com as células epiteliais. Alguns dos genes significativamente alterados (P<0,05) fazem parte de vias de sinalização importantes como a da via PI3K/Akt, que é fundamental durante o período do desenvolvimento pré-implantação, a via ECM-receptor interaction, que está diretamente relacionada com processos do contato inicial do embrião com o endométrio materno, a via de sinalização Cytokine-cytokine, que é crucial durante as respostas imunológicas e inflamatórias, dentre outras. Com os resultados gerados neste estudo, foi possível gerar pela primeira vez o modelo in vitro que mimetiza o microambiente de comunicação materno embrionária inicial com a troca de VEs entre células endometriais e embrionárias. Esperamos utilizar o conhecimento aqui gerado, para esclarecer os efeitos específicos das VEs, tornando o ambiente da fertilização in vitro mais próximo ambiente in vivo. Materno-embrionária, Vesículas extracelulares, Epitelial, Estromal, Trofectoderma

In ruminants, maternal recognition of pregnancy (MRP) involves the production of interferon tau (IFNT) by the trophectoderm (TE) cells of the embryo to prevent luteolysis. Although IFNT signaling is well characterized, the production and release of extracellular vesicles (Evs) has emerged as a potential mechanism of cellular communication between mother and embryo during MRP. Thus, the hypothesis of this project is that endometrial and TE cells cultivated in vitro can produce and release Evs, which can be internalized and modulate the transcriptome in the target cells. To test this hypothesis, we generated cultures of endometrial cells (epithelial and stromal) and TE cells from IVF blastocysts. After, Evs were isolated from the culture media. The epithelial and stromal cell lineages (n = 5) were maintained until the 4^th passage and were characterized by immunofluorescence (anti-cytokeratin, epithelial cells and anti-vimentin, stromal cells). TE cells from IVF embryos were cultured until the 2^nd passage and characterized by immunofluorescence (anti-CDX2). Evs were evaluated for particle size and concentration using Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Regarding the characterization of endometrial cells, only epithelial cells were positive for cytokeratin and stromal cells were positive for vimentin, as expected. TE cells were positive for CDX2. The Evs showed average size of 131.92 ± 5.52, 153.46 ± 7 and 143.66nm ± 4.60 and concentration 6.54E+08 ± 4.57E+07, 8.15E+08 ± 4, 59E+07 and 2.56E+11 ± 1.61E+10 particles/mL, for epithelial, stromal and TE cells, respectively. There was no significant difference (P>0.05) between the groups. The characterization of the Evs by Western blotting confirmed the presence of ALIX and the absence of the GRP78 protein in the Evs. Furthermore, transmission electron microscopy (TEM) showed that Evs have the expected morphology and size (<150nm). To simulate maternal- embryonic crosstalk in vitro and investigate how Evs modulate transcripts in target cells, we performed the treatment of endometrial cells with Evs from TE and vice versa, the treatment of TE cells with Evs from endometrial cells. After 6 hours of treatment, RNAseq revealed that Evs from the TE lineage more broadly altered the transcriptional profile of stromal cells compared to epithelial cells. Some of the significantly altered genes (P<0.05) are related with important signaling pathways such as PI3K/Akt pathway, fundamental during the pre- implantation development period, ECM-receptor interaction pathway, directly related with the early contact of the embryo with endometrium, Cytokine-cytokine signaling pathway, crucial during immunological and inflammatory responses, among others. Herein, we generate for the first time, an in vitro model that mimics the microenvironment of early embryonic maternal interaction by the exchange of Evs between endometrial and embryonic cells. The knowledge generated here will clarify specific effects of Evs, providing the IVF environment more similar to the in vivo.