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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.10.2020.tde-11022020-120605
Documento
Autor
Nombre completo
Maria Fernanda de Paula Ribeiro
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2019
Director
Tribunal
Nishiyama, Ana Claudia Oliveira Carreira (Presidente)
Barbeito, Claudio Gustavo
Nogueira, Renata Avancini Fernandes
Título en portugués
Papel do secretoma de linhagens de câncer de mama em modelo de angiogênese experimental
Palabras clave en portugués
Angiogênese
Câncer de mama
Ensaio de CAM
Exossomos
Resumen en portugués
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos. O câncer de mama é caracterizado pelo crescimento descontrolado de células da mama que adquiriram características anormais, e pode se apresentar de formas distintas como: carcinoma in situ, carcinoma invasivo, carcinoma metastático, adenocarcinoma e sarcoma. Cerca de 25% dos novos casos de câncer ao ano são de mama, entre eles apenas 1% atinge os homens. Atualmente tem sido descritas moléculas secretadas em vesículas de diferentes tamanhos por células que atuam como comunicadores celulares carregando diferentes tipos de proteínas, citocinas, fatores de crescimento e RNAs não codificadores. Dentre essas vesículas estão os exossomos, que são vesículas de membranas secretadas com 40-150nm de diâmetro, formadas durante o invaginamento de endossomos tardios e que são potentes fatores pró-angiogênicos. Além de induzir a angiogênese, são importantes biomarcadores tumorais. Estimulam a proliferação celular endotelial, migração e a formação do tubo in vitro. Promovem a proliferação de células endoteliais e formação de vasos. Influenciam a progressão do tumor, metástase e a eficácia terapêutica. Neste trabalho comparamos dois protocolos de isolamento de exossomos utilizando meios condicionados de células de linhagem de mama não maligna MCF10A e maligna Hs578T utilizando a estratégia de ultrafiltração combinada apenas à ultracentrifugação ou à ultracentrifugação e precipitação com um kit comercial visando a análise do papel angiogênicos em modelos experimentais de angiogênese. Analisamos o potencial angiogênico de exossomos isolados de meio condicionado da linhagem mais maligna de células de câncer de mama através de um modelo experimental de angiogênese utilizando células da veia do cordão umbilical (HUVEC) em gel de fibrina, e padronizamos a histologia da membrana corioalantoide de embrião de galinha para futuros ensaios com os exossomos isolados. Determinamos que o melhor protocolo para o isolamento de exossomos das linhagens de mama foi o protocolo que envolveu a estratégia de ultrafiltração seguida apenas de ultracentrifugação. Foi isolado maior quantidade de exossomos nas células não malignas MCF10A em ambos os protocolos testados. O teste da adição dos exossomos isolados das células Hs578T no gel de fibrina, contendo células HUVEC semeadas em microcarregadores, mostrou o papel angiogênico dessas partículas após 6 dias em cultura. Análises futuras da aplicação dos exossomos isolados na membrana corioalantide de embrião de galinha (CAM) poderão comprovar o papel angiogênico ex-vivo dessas partículas isoladas de diversas células de mama com diferentes graus de malignidade. Espera-se desta forma determinar o nível angiogênico do secretoma das linhagens de câncer de mama, visando um modelo para testar drogas e medicamentos que possam diminuir a angiogênese no câncer.
Título en inglés
The role of secretome of breast cancer cell lines in an angiogenesis experimental Model
Palabras clave en inglés
Angiogenesis
Breast cancer
CAM assay
Exossomos
Resumen en inglés
Cancer is the name given to a group of over 100 diseases that have in common the disordered growth of cells that invade the tissues and organs. Breast cancer is characterized by uncontrolled growth of breast cells that have acquired abnormal characteristics, and may present in different forms such as carcinoma in situ, invasive carcinoma, metastatic carcinoma, adenocarcinoma and sarcoma. About 25% of new cancer cases a year are breast cancer, among them only 1% affects men. Molecules secreted in vesicles of different sizes by cells that act as cellular communicators carrying different types of proteins, cytokines, growth factors and non-coding RNAs have been described. Among these vesicles are exosomes, which are secreted membrane vesicles 40-150nm in diameter, formed during late endosome invagination and which are potent pro-angiogenic factors. In addition to inducing angiogenesis, they are important tumor biomarkers. They stimulate endothelial cell proliferation, migration and tube formation in vitro. They promote endothelial cell proliferation and vessel formation. They influence tumor progression, metastasis and therapeutic efficacy. In this work we compare two protocols for isolation of exosomes using conditioned media from MCF10A and malignant Hs578T non-malignant breast cells lineages using the ultrafiltration strategy combined only with ultracentrifugation or ultracentrifugation and precipitation with a commercial kit aiming at the analysis of angiogenic role in experimental angiogenesis models. We analyzed the angiogenic potential of exosomes isolated from conditioned media from the most malignant breast cancer cell line through an experimental model of angiogenesis using fibrin gel umbilical vein cells (HUVEC), and standardized the histology of the chorioallantoid membrane of chicken embryo for future trials with isolated exosomes. We determined that the best protocol for isolation of breast exosomes from breast cell lines was the protocol that involved the ultrafiltration strategy followed only by ultracentrifugation. High amount of exosomes in non-malignant MCF10A cells were isolated in both protocols tested. Testing for the addition of exosomes isolated from Hs578T cells to the fibrin gel containing HUVEC cells seeded on microcarriers showed the angiogenic role of these particles after 6 days in culture. Future analysis of the application of isolated exosomes in the chicken embryo chorioalanthide membrane (CAM) may prove the ex-vivo angiogenic role of these particles isolated from various breast cells with different degrees of malignancy. Thus, it is expected to determine the angiogenic level of the secretoma of breast cancer strains, aiming at a model for to test drugs and drugs that may decrease angiogenesis in cancer.
 
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Fecha de Publicación
2020-04-30
 
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