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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.10.2012.tde-04112013-151437
Documento
Autor
Nome completo
Bruno Machado Bertassoli
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2012
Orientador
Banca examinadora
Assís Neto, Antônio Chaves de (Presidente)
Fratini, Paula
Nishiyama, Ana Claudia Oliveira Carreira
Título em português
Obtenção, cultivo e expansão de células-tronco do saco vitelino de suínos domésticos (Sus scrofa)
Palavras-chave em português
Sus scrofa
Células-tronco mesênquimais
Cultura celular
Membranas extraembrionárias
Saco vitelino
Resumo em português
Anexos fetais como cordão umbilical, membrana amniótica e líquido amniótico foram recentemente sugeridos como fontes ideais de diferentes linhagens de células-tronco, devido à natureza não invasiva do procedimento de isolamento, a grande massa de tecido para colheita de células com alta eficiência e os potenciais de diferenciação. Portanto, o presente estudo teve como objetivo analisar morfologicamente as membranas extraembrionárias através de microscopia de luz e imunohistoquímica e analisar as células oriundas do saco vitelino suíno visando caracterizar qual seu potencial como possível fonte de células-tronco pluripotentes, para futuro uso na terapia regenerativa. Para a imunohistoquímica das membranas, as membranas foram processadas pelas técnicas rotineiras de histologia e em seguida os blocos foram cortados sequencialmente e colocados em laminas previamente silanizadas, o protocolo de imunohistoquímica foi o convencional utilizando os seguintes anti-corpos: Citoqueratina e VEGF. Foram feitos ensaios de concentração e viabilidade celular, avaliação do crescimento celular, caracterização por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos (CD105, NANOG, CD45 e Oct-3/4) e caracterização por imunohistoquímica utilizando os seguintes anti-corpo: CD90, CD105, CD117, Vimentina, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulina, Citoqueratina e PCNA. O saco vitelino situava-se na porção ventral do embrião, próximo ao cordão umbilical, se mostrando como uma estrutura pequena, contendo poucos vasos e com coloração amarelada, este também apresentou como uma estrutura trilaminar (endoderma, mesênquima e mesotélio), onde a endoderme possuía um epitélio simples cubico, o mesênquima possuindo uma grande quantidade de tecido conjuntivo e o mesotélio contendo células achatadas. O amnio mostrou-se ligado intimamente ao embrião, sendo a primeira membrana fetal considerando a ordem embrião/útero, possuía forma oval e coloração transparente, histologicamente esta membrana é composta por 2 camadas distintas, um epitélio simples pavimentoso e um mesênquima contendo uma substancia amorfa com pouca quantidade de células. A membrana coriônica mostrou-se pouco rugosa e a membrana alantóidea como uma estrutura em forma de meia lua, possuindo uma intensa vascularização, conforme a evolução da gestação fica quase impossível à percepção das duas, formando a membrana córioalantoidea. O córion é constituído por uma camada de células arredondadas, dispostas em formato linear, já o alantoide é caracterizado por seu mesênquima amorfo com uma quantidade pequena de células. Em relação a imunohistoquima todas as membranas expressaram os marcadores VEGF e Citoqueratina. As celulas do saco vitelino mostraram aderência ao plástico e possuindo uma morfologia fusiforme, semelhante a fibroblastos, estas atingiram a confluência de 70% em aproximadamente 20 dias, estas celulas foram mantidas ate a passagem 4, onde posteriormente ocorreu morte celular. Estas celulas possuíam imunofenoipagem semelhante as celulas-tronco mesênquimais e hematopoiéticas, expressando marcadores como CD105, CD90, CD117, Vimentina, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulina, Citoqueratina, Nanog e PCNA. Do estudo realizado pode-se concluir que: existem células especificas em cada membrana extraembrionária, e que as celulas oriundas do saco vitelino possuem características semelhantes as celulas-tronco mesênquimais e embrionárias, sendo considerada uma ferramenta importante para futuros estudos experimentais de terapia celular na medicina veterinária regenerativa.
Título em inglês
Obtainment, cultivation and expansion of stem cells from the yolk sac of domestic pigs (Sus scrofa)
Palavras-chave em inglês
Cell culture
Extrambryonics membranes
Mesenchymal stem cell
Sus scrofa
Yolk sac
Resumo em inglês
Fetal attachments as umbilical cord, amnion and amniotic fluid have recently been suggested as ideal sources of different strains of stem cells, due to the noninvasive nature of the isolation procedure, the large mass of tissue to harvest cells with high efficiency and potential differentiation. Therefore, this study aimed to analyze morphologically membranes extraembryonic by light microscopy and immunohistochemistry and analyze the cells from the yolk sac to characterize this cells as to potential as a possible source of pluripotent stem cells for future use in regenerative therapy. For immunohistochemistry, the membranes were processed by routine histological techniques, and then the blocks were cut sequentially and placed on silanized slides previously, the protocol was the immunohistochemistry conventional using the following antibodies: Cytokeratin and VEGF. Trials were made for concentration and cell viability, cell growth evaluation, and the characterization by flow cytometry using specific antibodies (CD105, NANOG, CD45 and Oct-3/4) and characterization by immunohistochemistry using the following antibody: CD90, CD105, CD117, vimentin, Stro-1, Oct-4, VEGF, beta tubulin, Cytokeratin and PCNA. The yolk sac stood in the ventral portion of the embryo near the umbilical cord, proving how a structure small, few vessels and with yellowed, this also presented as a trilaminar structure (endoderm, mesenchyme and mesothelium), where the endoderm had a simple cubic epithelium, the mesenchyme with a large amount of connective tissue and the mesothelium with flattened cells. The amnio shown to be deeply linked to the embryo, being the first membrane fetal considering the order embryo/uterus, and had oval-shaped transparent coloring, histologically this membrane is composed of two distinct layers, a simple squamous epithelium and mesenchyme containing an amorphous substance with a small amount of cells. The chorionic membrane showed little wrinkles and alantoic membrane structure as a crescent-shaped, having an intense vascularization, and the evolution of the pregnancy is almost impossible the perception of the two, forming the membrane chorioallantoid. The corium is constituted by a layer of round cells, arranged in linear format, as the allantois is characterized by its mesenchyme amorphous with a small amount of cells. Relative to immunohistochemical all membranes expressing VEGF and cytokeratin markers. The yolk sac cells showed adherence to plastic and a spindle-like morphology, similar to fibroblasts, they reached confluence of 70% in about 20 days, these cells were maintained until passage 4, where later cell death occurred. These cells had similar imunofenoipagem the mesenchymal stem cells and hematopoietic cells expressing markers such as CD105, CD90, CD117, vimentin, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulin, Cytokeratin, Nanog and PCNA. From the study it can be concluded that: there are specific cells in each extraembrionária membrane, and that the cells derived from the yolk sac have characteristics similar to mesenchymal stem cells and embryonic, and being considered an important tool for future experimental studies of cell therapy in medicine veterinary regenerative.
 
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Data de Publicação
2013-11-25
 
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