Fertilidade e viabilidade espermática pós-criopreservação são pontos fundamentais no sistema de produção animal que dependem da integridade e função de todas as estruturas que compõem o espermatozoide. Ademais, as biotécnicas aplicadas à pecuária, visando o incremento das taxas reprodutivas e, consequentemente, produtivas dos animais, dependem da criopreservação espermática. Entretanto, o uso de sêmen criopreservado de touros com subfertilidade ou touros férteis nos quais as células espermáticas perdem a sua viabilidade no processo de criopreservação, gera grandes prejuízos ao setor. O objetivo deste estudo foi associar técnicas funcionais e moleculares na avaliação do sêmen de touros com diferentes padrões de fertilidade e perfis de resistência à criopreservação espermática, com o intuito de identificar perfis funcionais e metabólicos em touros com padrões de subfertilidade e alta suscetibilidade ao processo de criopreservação. O estudo foi dividido em dois capítulos, o primeiro relacionado à taxa de fertilidade de touros usados em programas de IATF e o segundo, à maior e menor suscetibilidade ao processo de criopreservação. Em ambos foram realizadas análises espermáticas quanto às características funcionais (morfologia, cinética, integridade de membranas plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, integridade de DNA e status oxidativo) e perfis lipídico e metabólico por espectrometria de massas (LC-MS/MS). Nos dois capítulos as estatísticas englobaram: diferenças entre os grupos, correlação, análises de componentes principais (PCA) e discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA). No capítulo 1 foi realizada ainda a análise de interação, antes da comparação das variáveis entre os grupos, bem como análise de curva ROC com os metabólitos identificados. Neste capítulo foram analisadas amostras criopreservadas de touros Angus (Bos taurus) e Nelore (Bos indicus) com histórico de fertilidade conhecido em programas de IATF. O delineamento experimental usado foi um arranjo fatorial 2x2, com um fator sendo a raça (Angus vs Nelore) e o outro a fertilidade (alta vs baixa). Os grupos de alta fertilidade constituíram 40 amostras de touros Angus e 44 da raça Nelore, e os de baixa fertilidade. 40 amostras de Angus e 28 amostras de Nelore (n=152). Os resultados observados demonstraram uma clara diferença entre as raças Angus e Nelore, principalmente no perfil lipídico e metabólico. Entre as amostras de alta e baixa fertilidade, os resultados funcionais e metabólicos indicam alterações na função mitocondrial, quebra da homeostase oxidativa e danos à membrana plasmática nas amostras de baixa fertilidade, principalmente na raça Angus. As diferenças observadas no perfil metabólico dos grupos de alta e baixa fertilidade permitiram ainda a identificação de potenciais biomarcadores de fertilidade com valores elevados de acurácia, sensitividade e especificidade. No capítulo 2, foram utilizadas amostras de sêmen coletadas, no mesmo dia, de touros sob o mesmo manejo e padrão de fertilidade. As amostras foram divididas em dois grupos, com maior e menor suscetibilidade ao processo de criopreservação, considerando-se a redução maior ou menor que 20% na motilidade espermática pós-criopreservação. Amostras de oito touros foram selecionadas para cada grupo, com a distribuição homogênea de raças. As análises funcionais foram realizadas apenas em amostras de sêmen criopreservado, enquanto as análises metabólicas foram feitas em plasma seminal, células in natura e criopreservadas. Os resultados funcionais demonstraram uma clara diferença entre os grupos quanto ao status do metabolismo energético, presença de EROs e preservação ou não de estruturas celulares. Quanto às análises de perfis lipídico e metabólico, os resultados também demonstraram diferenças entre os grupos relacionadas ao seu status funcional em todas as amostras biológicas analisadas. Vale salientar, no entanto, a diferença quanto ao perfil metabólico das células espermáticas no momento pré- criopreservação. Esta observação indica que a manutenção da viabilidade espermática durante a criopreservação depende da capacidade das células em absorver e utilizar estes metabólitos antes do início do processo de diluição, resfriamento e congelação. Como a fertilidade e a suscetibilidade à criopreservação são características multifatoriais, os resultados deste estudo, principalmente pela correlação entre os perfis funcionais e metabólicos, proporcionam uma maior compreensão das vias envolvidas no metabolismo energético e status oxidativo das células espermáticas, bem como abrem caminho para a definição de biomarcadores para identificação precoce de touros com problemas de subfertilidade ou alta suscetibilidade à criopreservação.

Fertility and sperm quality and viability post-cryopreservation are fundamental to the animal production industry and are related to the integrity and function of all sperm structures. Besides, the technologies used on livestock to increase animal reproductive rates depend on sperm cryopreservation. However, the use of sperm from bulls with subfertility issues or from fertile bulls with a high loss of sperm viability during the cryopreservation process implies great losses for the livestock industry. The aim of this study was the association of functional and molecular analysis for the evaluation of sperm from bulls with different fertility rates and cryopreservation resistance profiles to identify functional and metabolic profiles from bulls with infertility and cryopreservation issues. The study was divided into two chapters, the first related to the fertility rate of bulls used in FTAI programs and the second to bull sperm with higher and lower susceptibility to cryopreservation. In both, sperm samples were analyzed to access their functional status (morphology, kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, DNA integrity and oxidative status analysis) and their metabolic profiles (by LC-MS/MS analysis). The statistical analysis included: differences between groups by T-test, correlation, principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). In the first chapter, an interaction analysis was performed before comparing the variables between the groups and, considering the PCA results, a ROC curve analysis was also made with the metabolites detected. In this chapter, cryopreserved samples from Angus (Bos taurus) and Nellore (Bos indicus) bulls with known fertility history in FTAI programs were analyzed in a 2x2 factorial design, considering the breed (Angus x Nellore), the fertility factor (high vs low) as well as the interaction between those factors. High fertility groups were constituted of 40 Angus sperm samples and 44 Nellore sperm samples, and the low fertility groups of 40 Angus sperm samples and 28 Nellore sperm samples (n=152). Results showed a clear difference between the Angus and Nellore breeds, mainly in the lipid and metabolic profiles. Regarding the differences between the high and low fertility groups, the functional and metabolic results indicated the presence of mitochondrial disorders, oxidative stress, and damage to sperm structures, especially in low fertility Angus. The metabolic profile difference between high and low fertility groups allowed the identification of potential fertility biomarkers with high accuracy, sensitivity and specificity values. In chapter 2, sperm samples collected on the same day from bulls under the same management and fertility profile were used. Samples were divided into two groups, with higher and lower susceptibility to cryopreservation, considering a reduction of more or less than 20% in post-cryopreservation sperm motility. Samples of eight bulls with a homogeneous distribution of breeds were selected for each group. Functional analysis was performed only on cryopreserved sperm samples, while mass spectrometry analysis was performed on seminal plasma and pre and post-cryopreservation sperm cells. Functional results showed a great difference between the groups regarding energy metabolism status, ROS presence and integrity of cellular structures. Regarding the lipid and metabolic profile analysis, there were also differences between the groups in all biological samples analyzed, which corroborated their functional status. It is important to note, however, the metabolic profile difference between the groups observed in pre-cryopreservation sperm. This difference may indicate that the preservation of sperm viability during cryopreservation depends much more on its ability to absorb and use these metabolites before the dilution, cooling and freezing process. Considering that fertility and sperm susceptibility to cryopreservation are multifactorial, the results obtained in this study with the correlation between functional and metabolic profiles, provide a better understanding of the pathways involved in the sperm energy metabolism and oxidative status, as well indicate potential biomarkers for early identification of bulls with subfertility or high susceptibility to cryopreservation problems.