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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.10.2013.tde-25112013-133337
Document
Author
Full name
Henrique Fulaneti Carvalho
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2013
Supervisor
Committee
Arruda, Rubens Paes de (President)
Bittar, Juliana Nascimento
Celeghini, Eneiva Carla Carvalho
Title in Portuguese
Avaliação da adição dos protetores celulares mio-inositol e ácido ferúlico ao meio de congelação na qualidade do sêmen criopreservado de equinos
Keywords in Portuguese
Criopreservação
DCFH-DA
Garanhão
Resazurina
Abstract in Portuguese
A criopreservação do sêmen é de muita importância para a produção de equinos pois permite o amplo comércio internacional de sêmen e a redução dos custos com transporte de animais. Entretanto, o sêmen criopreservado apresenta reduzida longevidade e integridade funcional, um obstáculo para a expansão dessa técnica. Recentes descobertas sugerem que os maiores danos durante a criopreservação de sêmen de garanhões ocorrem devido ao desequilíbrio osmótico e às espécies reativas de oxigênio. Um método para combater os efeitos deletérios da congelação é utilizar substâncias que possam amenizar os danos subletais. O objetivo desse experimento foi avaliar o efeito da adição de duas substâncias com efeito protetor celular (mio-inositol e ácido ferúlico) ao meio de congelação, na qualidade do sêmen criopreservado de garanhões. Para isso foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 5 garanhões. O sêmen foi processado para criopreservação e antes do envase foi dividido em 3 tratamentos: controle, mio-inositol (30mM) e ácido ferúlico (160 µM). As palhetas foram descongeladas e analisadas quanto a motilidade computadorizada (CASA), integridade de membrana, estado metabólico e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em microscopia de epifluorescência nos tempos 0, 2 e 4h de incubação a 37°C. Previamente foram realizadas validações da técnica de mensuração simultânea da membrana plasmática e estado metabólico (sondas PI, H33342 e resazurina) e correlação entre duas técnicas de mensuração de EROs (DCFH-DA e DCFH-DA com H33342). Os dados obtidos foram avaliados no programa SAS, versão 9,3 (SAS, 2011) utilizando ANOVA e medidas repetidas no tempo, para as validações foram realizadas regressões lineares simples. A adição de mio-inositol no diluidor de congelação resultou em maior motilidade total no tempo 2h e 4h e maior motilidade progressiva nos tempos 0 e 2h de incubação pós-descongelação em relação aos outros grupos. O tratamento com mio-inositol resultou em maior quantidade de células com membrana plasmática íntegra nos tempo 0h (53,3±1,4%); 2h (50,0±1,0%) e 4h (37,9±1,5%) de incubação que o grupo controle: 0h (48,0±1,0%); 2h (44,9±1,1%); e 4h (31,5±1,7%). O ácido ferúlico prejudicou as características de motilidade (CASA) e a integridade da membrana plasmática, entretanto melhorou o estado metabólico em todos os tempos. Conclui-se que o mio-inositol melhora as características de motilidade e a integridade de membranas espermáticas do sêmen criopreservado de equinos e que o ácido ferúlico apesar de prejudicar essas características promove melhor metabolismo espermático, mensurado pela técnica de redução da resazurina.
Title in English
Evaluation of the addition of cell protectors myo-inositol and ferulic acid to the cryopreservation medium on equine thawed sperm quality
Keywords in English
Cryopreservation
DCFH-DA
Resazurin
Stallion
Abstract in English
Sperm cryopreservation is of great importance for equine production, it assists in the international semen trade and reduce costs with animal transportation. However, frozen/thawed semen has reduced longevity and functional integrity and these is an obstacle to the expansion of this technique. The improvement in quality of cryopreserved semen is very important, especially to help become available more widely new technologies, such as sperm sexing. Recent findings suggest that the greatest damage during cryopreservation of stallion semen occur due to osmotic imbalance and the reactive oxygen species (ROS). One method to mitigate the deleterious effects of freezing is using substances that might lessen the sublethal damage. The objective of this experiment was to evaluate the quality of frozen/thawed stallion sperm after using two substances that have protective effects in the freezing medium: myo-inositol and ferulic acid. Were performed five sperm collection of 5 stallions. The semen was processed and before cryopreservation it was divided into three treatments: control, myo-inositol (30 mM) and ferulic acid (160 mM). The straws were thawed and analyzed at 0, 2 and 4 h of incubation time at 37°C. It was performed computerized motility (CASA), membrane integrity, metabolic status and ROS production using an epifluorescence microscope. Before beginning of the experiment were carried out validations of the technique of simultaneous assessment of plasma membrane and metabolic state (PI probes, H33342 and resazurin) and correlation between two measurement techniques ROS (DCFH-DA and DCFH-DA with H33342). The data were analyzed using the SAS version 9.3 (SAS, 2011) with ANOVA and repeated measures. For the probes validation were used linear regressions. The addition of myo-inositol in the freezing extender resulted in higher total motility in time 2h and 4h and increased progressive cells at 0 and 2 h of incubation post-thaw compared to the other groups. Treatment with myo-inositol resulted in a higher number of cells with intact plasma membrane in time 0h (53.3 ± 1.4%); 2h (50.0 ± 1.0%) and 4h (37.9 ± 1.5%) of incubation than the control group: 0h (48.0 ± 1.0%), 2h (44.9 ± 1.1%), and 4h (31.5 ± 1.7%). The use of ferulic acid resulted in the worst characteristics of motility (CASA) and plasma membrane integrity, however improved metabolic status at all incubation times. It is concluded that myo-inositol improves sperm motility characteristics and preserves membrane integrity of equine cryopreserved semen. Ferulic acid although impairing these characteristics, promotes better sperm metabolism, measured by resazurin test.
 
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Publishing Date
2013-12-04
 
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