O desenvolvimento embrionário pré-implantacional é marcado pelos primeiros eventos de diferenciação celular em mamíferos. O primeiro evento de segregação celular consiste na separação entre a massa celular interna (MCI) e o trofectoderma (TE), enquanto a segunda diferenciação é o momento da separação entre epiblasto (EPI) e endoderma primitivo (PrE) dentro da MCI. Os mecanismos moleculares que controlam essa diferenciação envolvem a expressão temporal de fatores de transcrição específicos. Dados recentes indicam que o estudo do desenvolvimento embrionário inicial bovino seria um bom modelo para humanos. Sabe-se que, em camundongos, o fator de transcrição NANOG atua opostamente a outro fator de transcrição, GATA6 e as análises de expressão gênica agrupam populações celulares de forma que NANOG e GATA6 tornam-se mutuamente excludentes em EPI e PrE. O presente projeto procurou testar a hipótese de que NANOG é necessário para a especificação de EPI e repressão de PrE em embriões bovinos. Para tal, almejou-se realizar a deleção gênica de NANOG mediada por CRISPR/Cas9 em zigotos produzidos in vitro. Os grupos experimentais consistiram em zigotos microinjetados 8 ou 16 horas após a FIV com os RNA guias visando a deleção do gene NANOG em duas concentrações, 12,5 ou 80 ng/µl, e Cas9, sendo denominados Cas9-12,5 e Cas9-80, respectivamente, enquanto o grupo controle não foi microinjetado. Posteriormente os embriões foram cultivados para avaliação das taxas de clivagem, formação de blastocistos e desenvolvimento, análise da expressão proteica por imunofluorescência, análise de expressão gênica e genotipagem. Foi avaliada a expressão proteica de SOX17, um marcador de PrE por imunofluorescência, entretanto, nenhum dos blastocistos do grupo Cas9-12,5 apresentou a deleção esperada no gene NANOG. Foi observada uma diminuição importante da expressão de NANOG no grupo experimental Cas9-80 quando comparado ao grupo controle (p=0.0360), indicando que houve uma perturbação da expressão gênica, porém sem indícios de deleção total de NANOG nestas condições. As condições de tratamento do grupo Cas9-80, entretanto, não afetaram a expressão gênica de GATA6. Portanto, foi possível reduzir a expressão de NANOG com uso do sistema CRISPR em bovinos, sem alteração na formação de blastocistos e na expressão de GATA6, o qual tem relação com a diferenciação em PrE.

The early cell differentiation events mark the preimplantation embryonic development in mammals. The first cell differentiation event consists of the segregation between the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM), while the second event occurs within the ICM, with the segregation of epiblast (EPI) and primitive endoderm (PrE) lineages. The molecular mechanisms in the control of these events include time- related expression of specific transcription factors. Recent data indicate that the study of bovine embryos would be a good model for early human development. In mice, the transcription factor NANOG works opposite to another transcription factor, GATA6, and gene expression leads to cell population clusters in such a way that NANOG and GATA6 become mutually exclusive in EPI and PrE. This study sought to test the hypothesis that NANOG is necessary for EPI specification and PrE repression in bovine embryos. For this purpose, this study targeted CRISPR/Cas9-mediated NANOG deletion of in vitro produced zygotes. The experimental groups consisted of microinjected embryos with guide RNAs in two concentrations, 12.5 or 80 ng/µl, and Cas9 protein (Cas9-12.5 and Cas9-80) aiming to delete the NANOG gene, while the control group was not microinjected. Subsequently, embryos were cultured for evaluation of cleavage rates, blastocyst formation, and development rates, protein expression analysis by immunofluorescence, gene expression analysis, and genotyping. The protein expression of SOX17, a marker of PrE, was evaluated by immunofluorescence, however, none of the Cas9-12.5 embryos presented the expected gene deletion of NANOG. A significant decrease in NANOG expression (p=0.0360) was observed in the Cas9-80 experimental group when compared to the control group, suggesting a disturbance of gene expression, but with no evidence of NANOG full deletion under these conditions. The Cas9-80 treatment conditions, however, did not affect GATA6 gene expression. Therefore, it was possible to reduce the expression of NANOG using the CRISPR system in cattle embryos, without changing the blastocysts formation and the expression of PrE differentiation-related gene GATA6.