O primeiro evento de diferenciação celular em mamíferos consiste na separação entre a massa celular interna (MCI) e o trofectoderma (TE). Em camundongos, a via de sinalização HIPPO atua no controle da expressão de genes que definem essa diferenciação. Em bovinos, há indícios que os mesmos genes não participam da mesma maneira, porém a via HIPPO pode estar implicada nesse evento biológico. No presente estudo buscou-se testar a hipótese de que a atividade da proteína quinase LATS2 é necessária para a diferenciação da MCI em embriões bovinos. Para isso, realizou-se edição gênica via sistema CRISPR/Cas9 com intuito de inibir a função quinase de LATS2. Zigotos bovinos produzidos in vitro foram microinjetados com RNAs guia para o gene LATS2 acrescidos da enzima de restrição Cas9. Os zigotos foram separados em 3 grupos experimentais, sendo: grupo controle (não microinjetado), grupo Cas9 (microinjetado apenas com a proteína Cas9) e grupo gRNA (microinjetado com dois RNAs guias para o gene LATS2 e proteína Cas9). Os embriões foram cultivados para avaliação da taxa de formação de blastocistos, distribuição celular e fixados em paraformol 3,8% para posterior realização da imunofluorescência para YAP, seguido de avaliação de genótipo. Os resultados obtidos sugeriram que a clivagem não foi afetada no grupo editado, sendo as taxas 58%, 36% e 50% para grupo controle, Cas9 e gRNA respectivamente; porém, as taxas de formação de blastocisto sugeriram uma interferência direta no grupo editado, sendo 30%, 10% e 6% respectivamente, para os grupos controle, Cas9 e gRNA. Observou-se no âmbito morfológico que os embriões do grupo gRNA aparentavam estruturas assemelhadas a mórulas, sugestivo de morte embrionária ou bloqueio da diferenciação nessa fase do desenvolvimento. Houve redução numérica no número de células nas estruturas do grupo gRNA. As imagens obtidas via microscopia confocal, após a realização de imunofluorescência para YAP, demonstram a marcação de células do TE nos embriões microinjetados apenas com Cas9 e controle, porém, essa marcação não ocorreu nas no grupo gRNA em embriões que não formaram blastocele. Após a extração individual de DNA dos embriões testados na imunofluorescência, a PCR da região alvo de LATS2 resultou em uma banda de 478pb, além da banda original de 650pb, em uma amostra do grupo gRNA. Após sequenciamento dos produtos de PCR pelo método Sanger, constatou-se a alteração genética oriunda da deleção de trecho do gene LATS2 em 2 embriões, demonstrando o sucesso da edição gênica e corroborando com os demais achados. Isso sugere que a via HIPPO possui papel significativo na diferenciação de MCI e TE em embriões bovinos e de que o gene LATS2 está ligado à formação de blastocistos na espécie bovina.

The first cellular differentiation event in mammals consists of the separation between the internal cellular mass (ICM) and the trophectoderm (TE). In mice, the HIPPO signaling pathway acts to control the expression of genes that define this differentiation. In cattle, there are indications that the same genes do not participate in the same way, but the HIPPO pathway may be involved in this biological event. In the present study we aimed to test the hypothesis that the activity of LATS2 kinase is necessary for the differentiation of ICM in bovine embryos. In order to achieve this, we employed CRISPR/Cas9 gene editing system to inhibit the kinase function of LATS2. In vitro produced bovine zygotes were microinjected with RNAs guide aiming the LATS2 gene plus Cas9 restriction enzyme. The zygotes were sorted in 3 experimental groups: control group (not microinjected), Cas9 group (microinjected only with Cas9 protein) and gRNA group (microinjected with guide RNAs aiming the LATS2 gene and Cas9 protein). The embryos were cultured to evaluate the rate of blastocysts formation, cellular distribution, then fixed in 3.8% paraformol for subsequent immunofluorescence for YAP, followed by genotyping. The results suggested that the cleavage was not affected in the edited group, as rates were 58%, 36% and 50% for control , Cas9 and gRNA groups respectively; however, the blastocyst formation rates suggested a direct interference in the edited group, being 30%, 10% and 6% respectively, for the control groups, Cas9 and gRNA. Morphologically, it was observed that the embryos of the gRNA group appeared as morulas, suggestive of embryonic death or inhibition of differentation in this phase of development. There was a numeric reduction in total cell count in the structures of the gRNA group. The images obtained via confocal microscopy, after performing immunofluorescence for YAP demonstrate the marking of cells of the TE and MCI in the microinjected embryos only with Cas9 and control, however, this marking did not occur in the microinjected structures that did not form a blastocoel. After individual DNA extraction from the embryos tested in immunofluorescence, PCR of the LATS2 target region resulted in a band of 478pb, in addition to the original 650pb band, in one sample of the gRNA group. After Sanger sequencing of PCR products, genetic alteration derived from deletion of part of the LATS2 gene was observed in 2 embryos, demonstrating gene editing success and corroborating the findings. This suggests that HIPPO pathway has a significant role in the differentiation of MCI and TE in bovine embryos and that the LATS2 gene is linked to the formation of blastocysts in bovine species.