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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.10.2016.tde-16032015-162004
Document
Author
Full name
Patrícia Monken de Assis
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2014
Supervisor
Committee
Assumpção, Mayra Elena Ortiz D'Avila (President)
Landim, Fernanda da Cruz
Milazzotto, Marcella Pécora
Title in Portuguese
Melatonina no cultivo in vitro de embriões bovinos: dinâmica e ação antioxidante
Keywords in Portuguese
AFMK
Caspase
Cultivo
Desenvolvimento
Estresse oxidativo
Abstract in Portuguese
A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido
Title in English
Melatonin on in vitro culture of bovine embryos: dynamics and antioxidante properties
Keywords in English
AFMK
Caspase
Culture
Development
Oxidative stress
Abstract in English
Melatonin (MEL) is a lipophilic indolamine with well-known antioxidant properties, by an scavenger action, producing its metabolites such as N1-acetil- N2- formil-5 metoxykinuramin (AFMK) or through a membrane receptor pathway (MT1 and MT2). Although, little is known about its stability and ideal dose on in vitro bovine embryo culture (IVC). In this work, to evaluate if there is any loss of MEL to the IVC systems, we determinate by HPLC, the real concentration of MEL in each system, with and without mineral oil, after the addition of different initial doses of MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), and then analyzed at different incubation period (0, 24, 72 e 144 hours). Then, it was evaluated the action and consumption of MEL in IVC of embryos submitted to induced oxidative stress. The IVC was done in controlled atmosphere (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). At Day 5, embryos over 16 cells were randomly divided in the treatments 0, 25, 50 and 100 ng/ml of MEL, and all received the induction with 5µM of menadione during 24 hours. After incubation, the media was collected for HPLC analysis (MEL and AFMK) and embryos returned for culture with DM until Day8 (D8). The blastocysts (D8) were designated to Reactive oxygen species (ROS) evaluation, total number of cell (nBLAST), detection of caspase-3 and -7 activity (CASP) and gene expression (GRP78, HSP60 and SOD1). Blastocyst rate (TXBL) was also assessed. Result show that there is no loss of MEL to the oil, or degradation over incubation time. At 50ng/ml there was a consumption of melatonin in the media and formation of AFMK (p<0.05), higher TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) and nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), lower ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) and CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), when in contrast with the group without MEL. However, there was no difference in gene expression. In conclusion, melatonin has a stable behavior in IVC system, which allows the use in system with and without oil. Also, at the dose of 50ng/ml has an antioxidant effect, improving quality and production of embryos culture in vitro at induced oxidative stress
 
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Publishing Date
2016-09-27
 
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