Na nova era da genética, o mundo das “ômicas ” revela novas informações para compreensão desde o código genético até a função de proteínas no organismo. O transcriptoma é definido como um conjunto de todas as moléculas de RNA expressas em uma determinada célula ou tecido. Entre as diferentes plataformas moleculares, ganham destaque o sequenciamento de RNA por short reads, o chamado RNA-seq, e por long reads, denominado Iso-Seq. A complexidade dos organismos está relacionada com mecanismos que expandem a capacidade codificadora do genoma, neste contexto, o splicing alternativo é um dos mecanismos moleculares capazes de aumentar significativamente o repertório proteico de um organismo. No splicing alternativo, contrário do que ocorre no splicing constitutivo em que a sequência de RNAm é fiel ao gene, os íntrons do pré-RNAm podem sofrer processamento, dando origem a uma ou mais isoformas. Hipotetizamos que os genes HSD3B e CYP11B sintetizassem diferentes isoformas, cujas proteínas resultantes fossem a explicação para diferença na síntese de aldosterona e cortisol, bem como a diferente ação do trilostano nas zonas glomerulosa e fasciculada. Este projeto teve como objetivo principal caracterizar as isoformas das enzimas esteroidogênicas e de genes tumorigênicos no córtex adrenal de cães sem endocrinopatias e com endocrinopatia adrenal, diagnosticada como Síndrome de Cushing ACTH-independente. Esta tese apresenta dados da análise de sequenciamento de transcritos completos pelo Iso-Seq, baseado na tecnologia de Sequenciamento de Molécula Única em Tempo Real (SMRT) e dados complementares de RNA-seq do sequenciamento de córtex das glândulas adrenais de cães depositados em repositório público denominado Sequence Read Archive (SRA). Neste projeto foram sequenciados 4 córtex de glândulas adrenais não tumorais e 3 carcinomas adrenocorticais de cães. Foi demonstrado que há apenas um locus para o gene HSD3B e um locus para o gene CYP11B. Foi encontrado um grande número de isoformas para cada gene que codifica enzimas da cascata esteroidogênica. Os resultados foram filtrados pelo controle de qualidade nonsense-mediated RNA decay (NMD) e infere-se alta probabilidade de serem verdadeiras 96 isoformas dentre as 178 descritas do gene STAR, 11 isoformas verdadeiras de 33 descritas do gene CYP11A1, 1 isoforma verdadeira de 22 descritas do gene HSD3B, 14 isoformas verdadeiras de 74 descritas do gene CYP17A1, 14 isoformas verdadeiras de 48 descritas do gene CYP21A2, e 2 isoformas verdadeiras de 7 isoformas da CYP11B. Não há diferença significativa quanto a produção de isoformas dos genes SF-1, GNAS, PRKACA, PRKACB, PRKAR1A, PRKAR1B, TP53, MC2R, SOAT1 e CTNNB1 no tecido tumoral e não tumoral em cães. Conclui-se que o sequenciamento de transcritos completos pela técnica Iso-Seq pelo sistema PacBio forneceram informações novas para melhorar a anotação do genoma do cão e compreender o mecanismo de expansão da capacidade dos genes da cascata esteroidogênica gerarem diferentes enzimas.

In the new era of genetics, the world of “omics” reveals new information for understanding from the genetic code to the function of proteins in the organism. The transcriptome is defined as a set of all RNA molecules expressed in a specific cell or tissue. Among the different molecular platforms, RNA sequencing by short reads, called RNA-seq, and by long reads, called Iso-Seq, are highlighted. The complexity of organisms is related to mechanisms that expand the coding capacity of the genome, in this context, alternative splicing is one of the molecular mechanisms capable of significantly increasing the protein repertoire of an organism. In alternative splicing, contrary to what occurs in constitutive splicing in which the mRNA sequence is faithful to the gene, the pre-mRNA introns can undergo processing, giving rise to one or more isoforms. We hypothesized that the HSD3B and CYP11B genes synthesized different isoforms, whose resulting proteins could explain the difference in aldosterone and cortisol synthesis, as well as the different action of trilostane on the zona glomerulosa and fasciculata. The main objective of this project was to characterize the isoforms of steroidogenic enzymes and tumorigenic genes in the adrenal cortex of dogs without endocrinopathies and with adrenal endocrinopathy diagnosed as ACTH-independent Cushing’s Syndrome. This thesis brings together data from the sequencing analysis of full transcripts by Iso-Seq, based on the Single Molecule Real-Time Sequencing (SMRT) and complementary RNA-seq data from sequencing the cortex of the adrenal glands of dogs, deposited in a public repository called Sequence Read Archive (SRA). In this project, 4 non- tumor adrenal cortex and 3 adrenocortical carcinomas of dogs were sequenced. It has been shown that there is only one locus for the HSD3B gene and one locus for the CYP11B gene. A large number of isoforms were found for each gene encoding enzymes of the steroidogenic cascade. The results were filtered by nonsense-mediated RNA decay (NMD) quality control and then it was infered with a high probability of being true 96 isoforms of the 178 described of the STAR gene, 11 true isoforms of 33 described of the gene CYP11A1, 1 true isoform of 22 described of the gene HSD3B, 14 true isoforms of 74 described isoforms of the CYP17A1 gene, 14 true isoforms of 48 described of the CYP21A2 gene, and 2 true isoforms of 7 isoforms of CYP11B. There is no significant difference in the production of isoforms of the SF-1, GNAS, PRKACA, PRKACB, PRKAR1A, PRKAR1B, TP53, MC2R, SOAT1 and CTNNB1 genes in tumor and non-tumor tissue in dogs. It is concluded that the sequencing of complete transcripts by the technique Iso-Seq by the PacBio system provided new information to improve the annotation of the dog genome and to understand the mechanism of expansion of the capacity of the genes of the steroidogenic cascade to generate different enzymes.