A criopreservação do sêmen suíno ainda é um grande desafio em decorrência de diferenças no potencial de criotolerância dos ejaculados que influenciam a qualidade do sêmen descongelado. O holding time (HT) é uma alternativa utilizada nos protocolos de criopreservação para melhorar a qualidade do sêmen descongelado, é caracterizado pela refrigeração do sêmen à 17 ºC anterior à criopreservação. Entretanto, não se sabe o período ideal de manutenção dessa refrigeração. Durante esse período ocorrem interações não conhecidas entre os espermatozoides e o plasma seminal (e diluidor) que podem alterar o potencial de criotolerância de forma distinta entre ejaculados de alta e baixa congelabilidade. Para tentar compreender essas interações, a utilização da metabolômica como ferramenta molecular é essencial, já que a metabolômica é considerada o fenótipo bioquímico das células/fluídos em determinado momento. O presente estudo teve como objetivo 1) verificar qual o período de HT ideal para criopreservação; 2) verificar se a congelabilidade dos ejaculados é afetada pelo uso do HT; e 3) averiguar os efeitos do HT sobre a congelabilidade dos ejaculados no metaboloma dos espermatozoides e do plasma seminal (PS) de suínos. No primeiro estudo, o sêmen foi criopreservado utilizando sete diferente período de HT (0, 4, 8, 12, 24, 28 e 32 horas). Os resultados do sêmen descongelado mostraram que para a motilidade total e progressiva e para a integridade das membranas plasmática e acrossomal os melhores resultados foram obtidos com 24 horas de HT. Para o segundo estudo foi feita uma coleta de cada um dos 27 cachaços. Estes ejaculados foram criopreservados com (24 horas) e sem (0 horas) o uso de HT; após cada período de HT (0 e 24 horas) o PS e os espermatozoides foram separados para posterior análise do metaboloma. Do total de ejaculados cinco foram classificados como de alta (EAC) e cinco como de baixa (EBC) congelabilidade com base na perda de motilidade total e integridade de membrana plasmática. Foi observado interação entre o uso de HT e a congelabilidade dos ejaculados, ou seja, os EAC somente são capazes de demostrar esse potencial se criopreservados após 24 horas à 17ºC. Ainda, foram realizadas as análises metabolômicas do PS e dos espermatozoides antes e após o HT dos EAC e EBC. Com essas análises foi possível descrever que a assinatura metabolômica dos espermatozoides é decorrente das diferenças de congelabilidade inerentes ao ejaculado, caracterizada pelas alterações de abundância de alguns metabolitos entre os grupos experimentais. Já a assinatura metabolômica do PS é decorrente das diferenças intrínsecas ao HT, caracterizada pelas alterações na abundância dos metabólitos entre os ejaculados que passaram ou não por HT. Com isso, é possível que a interação entre as diferenças dos metabólitos dos espermatozoides e do PS pode ser responsável por explicar os resultados observados na fisiologia dos espermatozoides descongelados.

Cryopreservation of boar semen is still a major challenge due to differences in the cryotolerance potential of ejaculates influencing post-thawed semen quality. Holding time (HT) is an alternative used in cryopreservation protocols to improve the quality of thawed semen, it is characterized by semen refrigeration at 17ºC before cryopreservation. However, the ideal period of holding is unknown. During this period, unknown interactions occur between spermatozoa and seminal plasma (and extender) that can alter the cryotolerance potential differently between high and low freezing ejaculates. To understand these interactions, the use of metabolomics as a molecular tool is essential, since metabolomics is considered the biochemical phenotype of cells/fluids at a given time. The present study aimed to 1) verify which is the ideal HT period for cryopreservation; 2) check if ejaculate freezability is affected by the use of HT; and 3) investigate the effects of HT on the ejaculate freezability on the metabolome of spermatozoa and seminal plasma (SP). For the first study, the semen was cryopreserved using seven different HT periods (0, 4, 8, 12, 24, 28 e 32 hours). The results of thawed semen showed that for total and progressive motility and the integrity of the plasma and acrosomal membranes, the best results were obtained after 24 hours of HT. For the second study, one sperm-rich fraction was collected from each of the 27 boars. These ejaculates were cryopreserved with (24 hours) and without (0 hours) the use of HT. After each HT period (0 and 24 hours) the SP and the spermatozoa were separated for further analysis of the metabolome. Of the total ejaculates, five were classified as high (EAC) and five as low (EBC) freezability based on the loss of total motility and integrity of the plasma membrane. An interaction was observed between the use of HT and the freezing of ejaculates, that is, EACs are only able to demonstrate their freezability potential if cryopreserved after 24 hours at 17ºC. Also, metabolomic analyzes of PS and spermatozoa were performed before and after HT of EAC and EBC. It was possible to describe that the sperm's metabolomic signature is due to the differences in freezability inherent to the ejaculate, characterized by changes in the abundance of some metabolites between the experimental groups. The SP metabolomic signature is characterized by the intrinsic differences to HT, characterized by changes in the abundance of metabolites between ejaculates cryopreserved with or without HT. Thus, the interaction between the differences in the metabolites of sperm and PS may be responsible for explaining the results observed in the physiology of thawed sperm.