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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.99.2019.tde-03102019-145053
Documento
Autor
Nome completo
Giselle Pacifico Sartori Damião
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Galisteo Junior, Andrés Jimenez (Presidente)
Cardoso, André Gustavo Tempone
Pimenta, Daniel Carvalho
Spencer, Patrick Jack
Título em português
Caracterização e avaliação da atividade enzimática da toxina tetânica submetida à radiação gama por Cobalto 60
Palavras-chave em português
Clostridium tetani
Proteínas - Estrutura
Radiação Gama
Tétano
Toxinas
Resumo em português
O tétano é uma doença aguda de alta letalidade que acomete os terminais nervosos impedindo a liberação de neurotransmissores inibitórios. Considerada uma das toxinas microbianas mais potentes, o tétano ainda é um grave problema de saúde pública em países subdesenvolvidos e sua principal forma de prevenção se dá através da imunização. A vacina antitetânica é produzida a partir da inativação da TeNT por formaldeído e pode causar diversos efeitos adversos. Uma alternativa atualmente estudada é o uso da radiação ionizante para a diminuição da toxicidade de proteínas melhorando sua capacidade imunogênica e reduzindo reações adversas pós-vacinais. A partir disso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar o efeito da radiação ionizante na estrutura da toxina tetânica submetida a diferentes doses de radiação gama por Cobalto 60 e analisar a atividade enzimática residual após a exposição à radiação. A modificação estrutural na toxina tetânica após a radiação foi determinada por SDS PAGE, que evidenciou uma modificação gradual no perfil das proteínas com perda no volume da banda conforme o aumento da dose e o surgimento de bandas a partir da dose de 5 kGy. A análise por MALDI-TOF demonstrou fragmentações nas massas moleculares conforme o aumento da dose e possíveis agregações de fragmentos proteicos em doses mais elevadas. Na análise da preservação dos peptídeos por digestão enzimática e espectrometria de massa, houve uma discreta modificação no reconhecimento até a dose de 4 kGy, nas doses subsequentes, o reconhecimento foi mínimo. A análise da atividade enzimática residual por fluorescência demonstrou preservação de 65% da atividade mesmo em doses mais elevadas. Na avaliação antigênica realizada por ELISA e Western Blot, foi possível observar o reconhecimento de anticorpos anti-TeNT frente às toxinas irradiadas nas diferentes doses, com queda gradual conforme o aumento da dose, mas permanecendo com níveis satisfatórios em todas as doses. Nossos dados sugerem que a radiação ionizante promoveu alterações estruturais na toxina tetânica, promovendo fragmentação e/ou agregação com o aumento da dose, porém também foi possível observar que a radiação atenuou a atividade enzimática e que seu reconhecimento antigênico mesmo em doses mais elevadas permaneceu com bons níveis o que indica a possibilidade de um possível uso como imunógeno, contudo, estudos da atividade enzimática sobre doses mais elevadas necessitam serem realizados.
Título em inglês
Characterization and evaluation of the tetanic toxin enzymatic activity, exposed to gamma radiation by Cobalt 60
Palavras-chave em inglês
Clostridium tetani
Gamma Radiation
Protein - Structure
Tetanus
Toxins
Resumo em inglês
Tetanus is an acute disease of high lethality which affects nervous terminals blocking the liberation of inhibitory neurotransmitters. Tetanus toxin (TeNT) is considered one of the most potent microbial toxins and the disease is still a major issue to public health in developing countries. Its prevention is based on immunization. Anti tetanic vaccine is produced by the inactivation of TeNT with formaldehyde, which may cause several side effects. On alternative for this is the use of ionizing radiation to reduce the toxicity and also improving its immunogenic capacity and finally reducing the post vaccination side effects. Therefore, the aim of this study is to characterize the effects of the ionizing radiation in the TeNT structure exposed to different gamma radiation doses by Cobalt 60 and also to assess the residual enzymatic activity. The structural modifications of the toxin after radiation was assessed by SDS PAGE, which revealed a gradual modification on protein profile with loss of the band volume according to doses increase, and the appearance of distinct bands in doses higher than 5kGy. MALDI-TOF analysis showed fragmentation in molecular masses according to doses increase and possible aggregation of the protein fragments in higher doses. In the analysis of the preservation of the peptides by enzymatic digestion and mass spectrophotometry, there was a slight modification of the the recognizing up to 4kGy doses, on the subsequent doses, the recognizing was minimal. The residual enzymatic activity analysis revealed that 65% of protein activity remained even in higher doses. TeNT antigenic evaluation assessed by ELISA and Western Blot revealed the recognizing of anti-TeNT antibodies even in higher doses with gradual decrease as doses increase, however satisfactory levels were observed in all doses. Our findings suggests that ionizing radiation promoted structural modifications in TeNT, such as fragmentation and/or aggregation, however it was possible to observe that the radiation attenuated the enzymatic activity and its antigenic recognition even in higher doses, however still with good levels, which indicates a possible usage as immunogen, yet more studies should be done to assess the enzymatic activity of TeNT in higher doses.
 
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Data de Publicação
2019-11-04
 
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