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Disertación de Maestría
DOI
10.11606/D.9.2012.tde-08032013-153415
Documento
Autor
Nombre completo
Joseane Sampaio
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2012
Director
Tribunal
Pinto Junior, Ernani (Presidente)
Lombardi, Ana Teresa
Nascimento, Elizabeth de Souza
Título en portugués
Cianopeptídeos inibidores de proteases produzidos por cianobactérias brasileiras
Palabras clave en portugués
Cianobactérias
Cianopeptídeos
Cianotoxinas
Inibidores de proteases
Microgininas
Toxicologia ambiental
Resumen en portugués
As cianobactérias são micro-organismos reconhecidos por seu potencial em produzir cianotoxinas que afetam não só o ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, mas também aos seres humanos, agindo em diversos órgãos e tecidos. Cerca de 600 metabólitos secundários produzidos por cianobactérias já foram descritos na literatura, sendo que muitos deles possuem potencial biológico. Os peptídeos de baixo peso molecular, produzidos por cianobactérias chamados cianopeptídeos, dos quais se podem citar as anabaenopeptinas, aeruginosinas, microviridinas, cianopeptolinas e microgininas, são compostos provindos do metabolismo secundário de cianobactérias e são descritos como inibidores de proteases e fosfatases em alguns sistemas biológicos. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar a ocorrência de cianopeptídeos em cianobactérias brasileiras e testar seu efeito de inibição da atividade sobre enzimas proteases. Os objetos de estudo foram: uma linhagem da espécie Sphaerospermopsis torques-reginae, duas de Cylindrospermopsis raciborskii, duas de Microcystis sp, uma de Oscillatoria e uma de Pseudanabena sp. A partir dos resultados obtidos pode-se afirmar que do total de linhagens analisadas, ao menos 4 destas parecem produzir os cianopeptídeos de interesse, quando avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD). Em seguida, culturas de duas linhagens de C. raciborskii (uma produtora e outra não produtora de saxitoxina) foram amostradas a cada 3 dias, para a avaliação do crescimento celular, produção de cianopeptídeos e de saxitoxina e suas variantes. Não foi possível confirmar a produção de cianopeptídeos nas duas linhagens desta espécie. Por outro lado, foi evidenciado um aumento da produção de saxitoxinas quando cultivada num meio sem nitrogênio em comparação com a condição controle. Quando analisada a linhagem de Microcystis sp. (LTPNA 08), produtora de microcistinas, foi possível confirmar por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) a produção de dois cianopeptídeos, sendo estes, duas microgininas. Desta forma, desenvolveu-se um método cromatográfico para a separação desses compostos e purificação por cromatografia líquida semi-preparativa, onde foi possível a obtenção de frações enriquecidas de microgininas e microcistinas-RR e LR, com cerca de 70%, 86% e 97% de pureza. Por fim, realizaram-se ensaios avaliando a atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) e aminopeptidase M (AMP M) com as frações isoladas de microgininas e microcistina-LR. A atividade da ECA foi ± 50% inibida pelas frações testadas de cianopeptídeos, microcistina-LR isolada e microcistins-lR comercial. A atividade da AMP M foi 100% e 24,5% inibida quando incubada com 20 µM da fração de microgininas e microcistina-LR, respectivamente. Desta forma, as microgininas isoladas de cianobactérias brasileiras, mostraram-se como importantes inibidores da ECA e AMP M, podendo, no futuro, serem utilizadas como compostos para o tratamento de patologias cardiovasculares e renais.
Título en inglés
Cyanopeptides proteases inhibitors produced by Brazilian cyanobacteria
Palabras clave en inglés
Cyanobacteria
Cyanopeptides
Cyanotoxins
Environmental toxicology
Microginins
Protease inhibitors
Resumen en inglés
Cyanobacteria are micro-organisms recognized for their potential to produce cyanotoxins that affect not only the ecosystem and other organisms of aquatic environments, but also humans, acting in various organs and tissues. Around 600 secondary metabolites produced by cyanobacteria have been described in the literature; many of them have biological potential. Low molecular weight peptides produced by cyanobacteria are called cyanopeptides, among them we can cite the anabaenopeptins, aeruginosins, microviridins, cyanopeptolins and microginins, these compounds are derived from secondary metabolisms of cyanobacteria and apparently cause inhibition of proteases and phosphatases in some biological systems. Therefore, this study targeted the identification of the occurrence of cyanopeptides in Brazilian cyanobacterias and testing its effect on the inhibition of proteases activity. The targets of study were: a strain of species Sphaerospermopsis torques-reginae, two strains of Cylindrospermopsis raciborskii, two strains of Microcystis sp. and, one strain of Pseudanabena and Oscillatoria sp. From the results obtained in this study it can be stated that at least four of the total of strains analyzed appear to produce cyanopeptides of interest, when analyzed by high-performance liquid chromatography whit phodo diodo array detector (HPLC-PDA). The cultures of two strains of C. raciborskii (a producer of saxitoxin and a non-producer) were sampled every 3 days for assessment of cell growth, production of cyanopeptides and saxitoxins. It was not possible to confirm the production of cyanopeptides in strains of this species. Nevertheless, an increase in production of saxitoxins was shown when cultivated in an environment without nitrogen, as compared to the control condition. When the strain of Microcystis sp. (LTPNA 08), a producer of microcystins, was analyzed, the production of two cyanopeptides was confirmed by using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). After confirmation, a method using HPLC-PDA was used to do the separation and purification of these compounds by semi-preparative chromatography, in which it was possible to obtain an enriched fraction of microginins, microcystin-RR and microcystin-LR with approximately 70%, 86% and 97% purity, respectively. Lastly, inhibition experiments were run with angiotensin-converting enzyme (ACE) and aminopeptidase M (AMP M) with the isolated fractions. The microginins fractions, MC-LR commercial and MC-LR isolated, showed an inhibition of ± 50% of the angiotensin-converting enzyme. The activity of AMP M was 100% and 24.5% inhibited when incubated with microginins and microcystin-LR fractions in a concentration of 20 µM, respectively. Thus, isolated microginins from Brazilian cyanobacteria have exhibited properties as potential therapeutic agents in development of inhibitors of ACE and AMP M, which can be a benefit of using these molecules in the treatment of cardiovascular and renal pathologies.
 
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Fecha de Publicación
2013-04-01
 
ADVERTENCIA: El material descrito abajo se refiere a los trabajos derivados de esta tesis o disertación. El contenido de estos documentos es responsabilidad del autor de la tesis o disertación.
  • CARNEIRO, Ronaldo Leal, et al. Análise simultânea da produção de microcistinas e microgininas durante o crescimento de duas linhagens de Microcystis aeruginosa. In 2º Congreso Ibérico de Cianotoxinas, Sevilla, 2011. IV Reunión de la red de estúdios em cianotoxinas.Sevilla : Padilla Libros, 2011. Resumo. Dispon?vel em: http://institucional.us.es/sevilla2011/pt/index.htm.
  • Dörr, F., et al. Avaliação da presença de glifosato sobre o crescimento e produção de toxinas de Microcystis aeruginosa. In 2º Congreso Ibérico de Cianotoxinas, Sevilla, 2011. IV Reunión de la red de estúdios em cianotoxinas.Sevilla : Padilla Libros, 2011. Resumo. Dispon?vel em: http://institucional.us.es/sevilla2011/pt/index.htm.
  • SAMPAIO, Joseane, et al. Produção de saxitoxinas por duas linhagens de Cylindrospermopsis raciborskii na ausência de nitrogênio. In 2º Congreso Ibérico de Cianotoxinas, Sevilla, 2011. IV Reunión de la red de estúdios em cianotoxinas.Sevilla : Padilla Libros, 2011. Resumo. Dispon?vel em: http://institucional.us.es/sevilla2011/pt/index.htm.
  • SAMPAIO, Joseane, CARNEIRO, Ronaldo Leal, e PINTO, Ernani. Saxitoxin (STX) production by Cylindropsermopsis raciborskii (cyanobacteria) in a without nitrogen medium. In XVI Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia, São Paulo, 2011. BJPS - Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences.São Paulo : BJPS - Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011. Resumo. Dispon?vel em: http://www.fcf.usp.br.
  • SAMPAIO, Joseane, PINTO, Ernani, e CARNEIRO, Ronaldo Leal. Comparação entre o crescimento e produção de clorofila-a por duas cepas de Cylindrospermopsis raciborskii produtora e não produtora de saxitoxinas. In XVII Congresso Brasileiro de Toxicologia, Ribeirão Preto, 2011. CBTOX 2011., 2011. Resumo. Dispon?vel em: http://www.sbtox.org.br/.
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