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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.9.2008.tde-19052009-200620
Documento
Autor
Nome completo
Alice Cristina Rodrigues
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2008
Orientador
Banca examinadora
Hirata, Rosario Dominguez Crespo (Presidente)
Capella, Marcia Alves Marques
Marcourakis, Tania
Reboucas, Nancy Amaral
Santos, Jose Eduardo Tanus dos
Título em português
Efeito da atorvastatina sobre a atividade funcional e expressão de transportadores de membrana do tipo ABC e SLC
Palavras-chave em português
Atorvastatina
Caco-2
CMSP
HepG2
Hipercolesterolemia
Lipídeos
Transportadores ABC
Transportadores SLC
Resumo em português
Os transportadores de membrana do tipo ATP Binding Cassette (ABC) e solute carriers (SLC) regulam a homeostase intracelular de fármacos, modificando a biodisponibilidade e possivelmente a eficácia terapêutica. A variabilidade na resposta a hipolipemiantes, como as vastatinas, tem sido associada a vários fatores genéticos e ambientais. Com a finalidade de avaliarmos os mecanismos de regulação da expressão dos transportadores pela atorvastatina, a expressão de RNAm de transportadores ABC (ABCB1, ABCG2 e ABCC2) e SLC (SLCO1B1, SLCO2B1 e SLC22A1) foi avaliada por RT-PCRq em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 18 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 22 pacientes hipercolesterolêmicos (HC) tratados com atorvastatina (10mg/dia/4 semanas). A possível associação entre o polimorfismo ABCB1 C3435T e a expressão de RNAm também foi avaliada. Os estudos in vitro foram realizados com as células das linhagens HepG2 e Caco-2. Foram avaliados os efeitos da atorvastatina na ativação de fatores de transcrição (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1 e PXR) por ensaio de mobilidade eletroforética retardada em gel de poliacrilamida (EMSA) e na meia-vida do RNAm do gene ABCB1 por RT-PCRq, e a expressão e atividade funcional da proteína ABCB1 por Western blot, imunohistoquimica e citometria de fluxo. A proteina ABCB1 foi localizada por imunohistoquimica na membrana apical do canalículo biliar das celulas HepG2 e na membrana apical das Caco-2. O tratamento das células HepG2 com atorvastatina causou redução da expressão de RNAm do gene ABCB1 e aumento na expressão dos genes ABCG2 e ABCC2. Esses efeitos foram dose e tempo dependentes. O tratamento com atorvastatina das células Caco-2 não modificou a expressão dos transportadores de efluxo após 30 a 120 min. Nas células HepG2, as concentrações de 10 e 20 M de atorvastatina causaram diminuição da expressão de ABCB1 (0 µM: 1,00 ± 0,06; 10 µM: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 µM: 0,69 ± 0,06, p< 0,05). A atividade da ABCB1, avaliada pelo efluxo de Rh123, mostrou-se estar reduzida em 41% nas células HepG2, após tratamento com atorvastatina 20 µM. Embora a diminuição da expressão do ABCB1 não tenha sido decorrente de uma menor ativação transcricional, avaliada indiretamente por EMSA, estudos de mecanismos de regulação pós-transcricionais, revelaram que a atorvastatina diminui a estabilidade de RNAm do gene ABCB1. Esse resultado parece estar de acordo com o ocorrido nas CMSP, já que o tratamento com atorvastatina diminuiu a expressão de RNAm do gene ABCB1 nos indivíduos HC. Essa modulação, no entanto não está associada à presença do polimorfismo ABCB1 C3435T. Em relação aos transportadores de captação, a expressão do SLC22A1 nas células Caco-2 diminui após tratamento com atorvastatina por 30 min e não foi modificada nas células HepG2. Já o gene SLCO2B1 encontrou-se muito aumentado após 24 h de tratamento nas células HepG2. Estudos in vivo nas CMSP, mostrou que a expressão de mRNA basal dos transportadores nos HC foi 10 vezes maior que nos NL e diminuiu após tratamento com atorvastatina nos HC. Com os resultados obtidos podemos sugerir que diferenças no efeito da atorvastatina nos tipos celulares podem ser em decorrência da expressão tecido-específica de fatores de transcrição. No modelo de hepatócito, HepG2, a atorvastatina é um inibidor do transporte mediado pela ABCB1 e é capaz de diminuir a síntese e a função da ABCB1, via aumento da degradação de RNAm do gene ABCB1. Em conseqüência ocorre uma redução do efluxo pelo sistema biliar, causando aumento da concentração intracelular. Ainda, podemos concluir que em CMSP o colesterol pode ser o responsável pela modulação dos genes dos transportadores de membrana e que isso pode implicar em diferenças na eficácia da atorvastatina.
Título em inglês
Effect of atorvastatin on the activity and expression of ABC and SLC membrane transporters.
Palavras-chave em inglês
ABC transporters
Atorvastatin
Caco-2
HepG2
Hypercholesterolemia
Lipids
PBMCs
SLC transporters
Resumo em inglês
Specific membrane transporters have a significant impact on drug absorption and disposition. Most of them belong to two super-families, ABC (ATP-binding cassette) and SLC (solute-linked carrier). Statins are important therapeutic agents in the management of hypercholesterolemia, and considerable inter-individual variation exists in response to its therapy. The effects of atorvastatin expression of efflux (ABCG2 and ABCC2) and uptake (SLCO1B1, SLCO2B1 and SLC22A1) drug transporters were investigated by qPCR in Caco-2 and HepG2 cell lines and in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of eighteen normolipidemic (NL) and twenty two hypercholesterolemic (HC) individuals treated with atorvastatin (10mg/day/4 weeks). The possible involvement of ABCB1 C3435T polymorphism in ABCB1 mRNA expression was also evaluated. In vitro studies with the cell lines HepG2 and Caco-2 were also performed. The effect of atorvastatin on the activation of the promoter of ABCB1 by transcription factors (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1, and PXR) was evaluated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), and ABCB1 mRNA half-life were measured by PCRq. The expression and functional activity of ABCB1 were investigated by Western blot, imunohistochemistry and flow cytometry. Immunohystochemical analysis revealed that ABCB1 is located at the apical membrane of the bile canaliculi in HepG2, and in apical membrane of Caco-2 cells. Atorvastatin treatment of HepG2 cells caused a decreased in ABCB1 and an increase in ABCC2 and ABCG2 transcript levels. These effects were time and dose-dependent. Treatment of Caco-2 cells did not present any differences in efflux transporters mRNA levels. Treatment of HepG2 cells with 10 and 20 M atorvastatin caused a reduction on ABCB1 expression (0 µM: 1,00 ± 0,06; 10 µM: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 µM: 0,69 ± 0,06, p< 0,05), and a 41% decrease in ABCB1-mediated efflux of Rhodamine123 (p < 0.01). Although reduced ABCB1 mRNA expression was not due to any repressor protein suppressing ABCB1 promoter activation, mRNA stability studies revealed that mRNA stability of ABCB1 was markedly decreased by atorvastatin treatment (2h versus 7h for control). In agrrement with these results, in PBMCs of HC individuals, atorvastatin treatment also reduced ABCB1 mRNA expression. However, the down-regulation was not associated with the presence of 3435T allele. For the uptake transporters, atorvastatin decreased SLC22A1 transcript levels after 30min-treatment and it was not regulated in HepG2. On the other hand, SLCO2B1 was up-regulated after 24h-treatment of HepG2 cells. In vivo studies with PBMCs revealed that during hypercholesterolemia all the drug transporters analyzed were increased almost 10-fold (p< 0.05), and after atorvastatin therapy the efflux and uptake transporters transcript levels were all down-regulated. These findings suggest that atorvastatin exhibits differential effects on mRNA expression of drug transporters depending on the cell type, which may be related to tissue-specific expression of transcription factors. Atorvastatin leads to decreased ABCB1 function and synthesis in HepG2 cells by increasing degradation of ABCB1 mRNA. Therefore, inhibition of ABCB1 may reduce atorvastatin elimination via bile, increasing its cellular concentrations. We also may suggest that in PBMCs cholesterol modulates mRNA expression of drug transporters, and this may contribute to the variability of response to atorvastatin.
 
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Data de Publicação
2009-05-29
 
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