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Tese de Doutorado
Documento
Autor
Nome completo
Maricy Alves Ribeiro
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2003
Orientador
Banca examinadora
Kanamura, Herminia Yohko (Presidente)
Alves, Venancio Avancini Ferreira
Chioccola, Vera Lucia Pereira
Genovez, Margareth Elide
Vaz, Adelaide Jose
Título em português
"Contribuição ao imunodiagnóstico da leptospirose humana: ênfase ao uso de anticorpos monoclonais"
Palavras-chave em português
anticorpos
anticorpos monoclonais
imunodiagnóstico
leptospirose humana
Resumo em português
A prova sorológica de referência na leptospirose ainda é a soroaglutinação microscópica (SAM). Devido à complexidade desta prova avaliamos alguns testes rápidos para triagem dos anticorpos anti-leptospiras na fase aguda da infecção. Na década de 80, uma hemaglutinação passiva, utilizando frações polissacarídicas de leptospiras, foi considerada apropriada ao diagnóstico precoce, porém esta preparação antigênica incluía muitos “antígenos comuns” reconhecidos por anticorpos de 4% dos indivíduos normais. Um novo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando uma suspensão de antígenos imunodominantes, resistentes à proteinase K, foi padronizado e avaliado quanto ao seu valor diagnóstico. Com 89,9% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, esta técnica, referida como PK-ELISA, satisfaz os requisitos necessários para as provas de triagem da leptospirose humana. No entanto, em virtude de alguns reagentes usados nesta preparação antigênica serem importados e muito instáveis, foi proposta a introdução de novos métodos empregando-se anticorpos monoclonais. Em um “Acordo de Pesquisa Cooperativa” entre o Instituto Adolfo Lutz e o Laboratório Fleury foram produzidos hibridomas contra leptospiras. Dois deles foram selecionados para dar continuidade ao estudo: um, secretando anticorpos monoclonais (AcM) para um epítopo detectado em 16 de 23 sorovares do gênero Leptospira mais freqüentes em nosso meio (clone A12P4), e outro específico a somente um sorogrupo patogênico, icterohaemorragiae (clone H7P1). O AcM A12P4, uma imunoglobulina G2B (IgG2B), reagiu com epítopo presente nos componentes de pesos moleculares (PM) de 16-18 kDa dos lisados de leptospiras das cepas RGA e M-20, quando separados na eletroforese em gel de poliacrilamida, e com componentes de PM de 75-84kDa dos sorovares copenhageni e canicola. Por sua vez, o AcM H7P1, uma imunoglobulina G, reagiu com um epítopo comum a várias frações de PM acima de 21 kDa da cepa RGA e com componentes de PM de 21-22 kDa e de 75-82 kDa da cepa M-20. Os monoclonais foram empregados em provas imunoenzimáticas para a detecção de anticorpos específicos em amostras séricas pareadas coletadas de 52 pacientes com leptospirose, e do grupo controle que incluiu amostras séricas de 57 pacientes com outras doenças consideradas no diagnóstico diferencial, e de 68 indivíduos normais. Estas provas, no entanto, não foram satisfatórias. Finalmente, um novo ELISA foi desenvolvido no presente estudo que utiliza a suspensão de antígenos “AgMc”, purificados por cromatografia de afinidade utilizando a Sepharose 4B ativada com CNBr acoplada aos anticorpos monoclonais descritos acima. Os resultados obtidos com esta prova foram comparados aos obtidos com outros testes disponíveis em nosso meio, como a SAM e o ELISA clássico (ELISA c). Este novo método, o “ELISA AgMc”, com 80,70 % e 83,33 % de sensibilidade e especifidade, respectivamente, em relação à SAM; valores preditivos positivo e negativo de 69,70% e 90,10% respectivamente e índice de concordância geral de 82,49%, não parece ser um protocolo promissor para o diagnóstico rápido na leptospirose humana. Além disso, tomando-se a SAM como diagnóstico verdadeiro, os resultados obtidos no novo teste, após a conclusão diagnóstica do grupo de pacientes com a leptospirose, mostrou uma discordância significativa. São discutidas as possíveis explicações para os resultados encontrados.
Título em inglês
Contribution to the immunodiagnosis of human leptospirosis: emphasis to monoclonal antibodies.
Palavras-chave em inglês
antibodies
human leptospirosis
immunodiagnosis
monoclonal antibodies
Resumo em inglês
The best serological test for leptospirosis laboratory diagnosis remains the microscopic agglutination test (MAT). Because of the complexity of MAT, we have been developed some rapid screening tests for leptospiral antibodies detection in the acute phase of infection. In the decade of 80, a passive hemagglutination test employing polysaccharide fractions of leptospires was considered appropriate for early diagnosis, but its antigen preparation included “common antigens” recognized by antibodies from 4% of healthy individuals. A new ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) employing proteinase K resistant immunodominant antigens was developed and its potential diagnosis evaluated. This technique, the PK-ELISA, presented 89.9% sensitivity and 97.4% specificity, and satisfied the requeriments needed for serological screening tests of human leptospirosis. However, some of the reagents used in its antigen preparation are imported and very unstable. So, it was proposed, in a “Cooperative Research Accordance” between Instituto Adolfo Lutz and Laboratório Fleury, to try new approaches with monoclonal antibodies. Two hibridomas secreting specific monoclonal antibodies (MAb) were selected: one, against an epitope detected in 16 of 23 members of the genus Leptospira (clone A12P4) and the other, specific to the icterohaemorragiae serogroup (clone H7P1). The MAb A12P4, a G2 (IgG2B) immunoglobulin, reacted with an epitope present in the 16-18 kDa components of icterohaemorragiae serogroup and with the 75-84 kDa components of serovars copenhageni and canicola, after whole-cell lysates of the leptospires were separated by sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis. The MAb H7P1, which is an IgG, reacted with an epitope common to several fractions of molecular weight above 21 kDa of strain RGA and with the 21-22 kDa and the 75-82 kDa components of strain M-20. Both monoclonal antibodies were employed in enzyme immunoassays for detecting specific antibodies in serum samples serially colleted from 52 patients with leptospirosis, and from the control group, which consisted of sera from 57 patients with other diseases included in the differential diagnosis, and from 68 healthy individuals. These tests, however, were not satisfactory. A new ELISA was developed in the present study employing an antigen suspension “AgMc”, purified by affinity chromatography with CNBr-activated Sepharose 4B coupled to the monoclonal antibodies described above. The results obtained with this test were compared to the MAT and to the classical IgM ELISA (ELISA c). The new method, “AgMc ELISA”, presented serological indices, relatively to reference test MAT, of 80.70 % and 83.33 % of sensitivity and specificity, respectively; positive and negative predictive values of 69.70 % and 90.10 %, respectively, and general agreement index of 82.49 %. So, this test was not considered a promising approach to rapid diagnosis of human leptospirosis. Moreover, the proportion of patients diagnosed as having leptospirosis by the “AgMc ELISA” and the MAT differ significantly. The possible explanations for the results obtained are discussed.
 
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Data de Publicação
2004-04-23
 
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