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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.9.2016.tde-13052016-141240
Documento
Autor
Nome completo
Graziela Batista da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2016
Orientador
Banca examinadora
Garcia, Primavera Borelli (Presidente)
Azevedo, Carla Cristina Lopes de
Prosdócimi, Fábio César
Gamero, Edgar Julian Paredes
Jaeger, Ruy Gastaldoni
Título em português
Remodelamento da matriz extracelular da medula óssea em desnutrição protéica: possível relação da via de AKT com a expressão de fibronectina e metaloproteinases de matriz
Palavras-chave em português
AKT/mTOR
Hemopoese e desnutrição proteica
LC3β
Matriz extracelular
Metaloproteinases de matriz
Resumo em português
A desnutrição proteica (DP) pode ocasionar alterações na matriz extracelular (MEC) de diferentes órgãos e tecidos, inclusive o hematopoético, com comprometimento funcional. Estudos do nosso laboratório demonstraram, em modelo murino de DP, aumento da expressão proteica de fibronectina (FN) no estroma medular ósseo in vivo, principalmente na região subendosteal (local de fixação da célula tronco progenitora hemopoética). Já in vitro, no estroma medular ósseo, observou-se tanto o aumento quanto a diminuição de FN e a presença de suas isoformas. Essas alterações de FN parecem estar envolvidas com a hipoplasia da medula óssea (MO) em camundongos desnutridos. As modificações quantitativas de FN podem ser devidas: (i) à ação das metaloproteinases de matriz (MMP) responsáveis pela degradação das proteínas da MEC; (ii) aos inibidores de metaloproteinases (TIMP) que regulam a degradação da MEC; (iii) às alterações transcricionais, reguladas pela via de AKT/mTOR, que controla os splicing alternativos na FN, resultando em isoformas dessa proteína; (iv) a processos pós-transcricionais modulados por LC3, que aumenta a tradução do RNAm de FN. Assim, o objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos que alteram o turnover de FN no estroma medular ósseo em modelo murino de DP. Utilizamos camundongos, C57BL/6J machos, adultos, separados em dois grupos: controle e desnutrido, alimentados, ad libitum, com ração contendo 12% e 2% de proteína, respectivamente. Após cinco semanas de indução à desnutrição os camundongos foram eutanasiados, e coletado o material biológico. Avaliamos: o estado nutricional, o hematológico, a histologia da MO femoral bem como a determinação imunohistoquímica da FN, MMP-2 e MMP-9, determinação da expressão de FN e suas isoformas em células totais da MO, o estabelecimento do estroma medular ósseo in vitro, por 28 e 35 dias de cultivo. A partir das culturas foram avaliadas a expressão de RNAm de FN e suas isoformas, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR e LC3α e β, quantificação de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ e IL-1β e determinação de LC3β e proteínas da via de AKT/mTOR. Não observamos alterações na expressão do RNAm de FN e suas isoformas ex vivo e in vitro, mas um aumento da deposição de FN na MO.Também não observamos modificações na imunolocalização de MMP-2 e MMP-9 na MO e na atividade dessas proteínas no sobrenadante de culturas de células estromais in vitro, mas houve aumento da expressão do RNAm de MMP-9 em 28 dias de cultivo. Não detectamos alterações na expressão de RNAm e na concentração de TIMP-1 e TIMP-2 no sobrenadante das culturas. Houve redução significativa de TNFα e TGFβ no sobrenadante das culturas de 28 dias. Observamos aumento da expressão do RNAm de mTOR em culturas de 28 dias e LC3α e LC3β em 35 dias de células estromais. Encontramos menor fosforilação de PI3K, AKT, PTEN, mTOR e mTOR total e aumento de LC3β em culturas de 28 dias, mas redução de LC3β em 35 dias. Em função dos dados inferimos que a DP conduz a alterações da FN que não estão relacionadas à ação de MMPs e TIMPs e sim a modificações de LC3β e da via de AKT/mTOR.
Título em inglês
Extracellular matriz remodeling of the bone marrow in protein malnutrition: possible relationship of AKT pathway with expression of fibronectin and matriz metalloproteínases.
Palavras-chave em inglês
AKT/mTOR
Extracellular matrix
Hemopoiesis
LC3β
Malnutrition
Matrix metalloproteinases
Resumo em inglês
Protein malnutrition (PM) can lead changes in extracellular matrix (ECM) from several organs and tissues, including hematopoietic, with functional impairments. Research from our laboratory demonstrated, in a murine model of protein malnutrition, increase in proteic expression of fibronectin (FN) in vivo bone marrow stroma, principally in subendosteal region (attachment site of hematopoietic stem/progenitor cell - HSPC). It was observed as both an increase and a decrease in the presence of FN and its isoforms in vitro bone marrow stroma. These FN changes seem to be related to bone marrow (BM) hypoplasia in malnourished mice. Quantitative FN changes may be due to: (i) action of matrix metalloproteinases (MMP) responsible for ECM proteins degradation; (ii) tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that regulate ECM degradation; (iii) transicional changes regulated by AKT/mTOR pathway, which controls alternative splicing in FN, resulting in isoforms from this protein; (iv) post-transcriptional processes modulated by LC3 that increases FN mRNA translation. Therefore, the aim of this study was to elucidade the mechanisms that changes the FN turnover in bone marrow stroma in a murine model of PM. C57BL/6J, adult and male mice were used and divided into two groups: control and malnourished, fed ad libitum with ration containing 12% and 2% of protein, respectively. After five weeks of induction malnutrition, mice were euthanized and the biological material was collected. We evaluated: nutritional and hematologic status, the femoral BM histology, immunohistochemistry determination of FN, MMP-2 and MMP-9, the FN and its isoforms expression determination in total BM cells, establishment of in vitro bone marrow stroma for 28 and 35 days of culture. From the cultures were evaluated FN mRNA expressions and its isoforms, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR, LC3α and β, quantification of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ and IL-1β and determination of LC3β and AKT/mTOR proteins. No changes were observed, ex vivo and in vitro, in the expression of FN mRNA and its isoforms, but there was a FN deposition increase in BM. We did not observe modifications in MMP-2 e MMP-9 immunolocalization in BM and in these proteins activity in the supernatant of in vitro stromal cell culture, but there was an increase in MMP-9 mRNA expression after 28 days of culture. We did not detect changes in mRNA and in TIMP-1 and TIMP-2 expressions in the supernatant of cultures. There was significant reduction of TNFα and TGFβ in the cultures supernatant of 28 days. We observed an increase of mTOR RNAm in 28 days cultures and also LC3α and LC3β in stromal cells with 35 days. We found lower phosphorylation of PI3K, AKT, PTEN, mTOR e total mTOR and an LC3β increase in 28 days cultures, yet an LC3β reduction in 35 days. According to the data we conclude that PM leads to FN changes that are not related to MMPs and TIMPs actions, but the LC3β and AKT/mTOR pathway modifications.
 
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Data de Publicação
2016-06-16
 
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