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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.9.2013.tde-07032013-102217
Document
Author
Full name
Lara Mendes de Almeida
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2012
Supervisor
Committee
Mamizuka, Elsa Masae (President)
Ferreira, Rita de Cassia Cafe
Gales, Ana Cristina
Levin, Anna Sara Shafferman
Pignatari, Antonio Carlos Campos
Title in Portuguese
Caracterização molecular dos mecanismos de resistência à linezolida em estafilococos coagulase-negativos e estudo da estabilidade do fenótipo resistente
Keywords in Portuguese
Estafilococos coagulase-negativos
Linezolida
Resistência microbiana às drogas
Abstract in Portuguese
Linezolida foi o primeiro fármaco da classe das oxazolidinonas a ser aprovado para o uso clínico. Esta nova oxazolidinona inibe a síntese protéica impedindo a formação do complexo de iniciação formado pelo mRNA, tRNA f-Met e a subunidade 50S do ribossomo bacteriano. Embora a resistência à linezolida possa ser mediada pelo produto do gene cfr ou por mutações nas proteínas ribossômicas L3, L4 e L22, o mecanismo de resistência mais comum envolve mutações no domínio V do gene rRNA 23S. Entre março de 2008 a dezembro de 2011, 38 cepas de estafilococos coagulase-negativos (SCNs) resistentes à linezolida (20 S. epidermidis, 14 S. haemolyticus, 3 S. hominis e 1 S. warneri) isoladas de hemoculturas e pontas de cateter de pacientes internados em dois hospitais terciários do Estado de São Paulo foram incluídas neste estudo para a determinação dos mecanismos de resistência e análise da estabilidade do fenótipo resistente. As cepas de SCNs apresentaram altos níveis de resistência à linezolida (CIMs de 16-128 µg/ml) e foram multi-resistentes, permanecendo sensíveis à vancomicina e teicoplanina. A mutação G2576T foi identificada no domínio V do gene rRNA 23S em todas as cepas de SCNs, exceto em uma cepa de S. haemolyticus. O gene cfr e mutações nas proteínas L4 e L22 não foram detectados. Em relação à proteína L3, todas as cepas de S. epidermidis do hospital A, incluindo a cepa controle sensível à linezolida, apresentaram a substituição Leu101Val, sugerindo que essa mutação seja um marcador clonal dessa população sem envolvimento com a resistência à linezolida. A única cepa proveniente do hospital B (S. epidermidis) foi selvagem para essa proteína ribossômica. Somente uma cepa de S. haemoyticus teve uma mutação no gene rplC, resultando na alteração Val154Leu. Em S. hominis, a mutação Phe147Ile foi identificada em uma cepa, enquanto a associação de Gly139Arg e Met156Thr foi observada nas outras duas cepas dessa espécie. A identificação dessas mutações na proteína L3 de cepas de S. haemoyticus e S. hominis resistentes à linezolida reforça o papel desses sítios na aquisição da resistência ao fármaco em Staphylococcus spp. No entanto, a presença de G2576T no rRNA 23S torna difícil determinar exatamente qual o envolvimento das mutações na L3 com os elevados níveis de resistência à linezolida apresentados por essas cepas. Na ausência da pressão seletiva do antimicrobiano, após 130 passagens, a resistência à linezolida mediada pela mutação G2576T permaneceu estável nas cepas de SCNs deste estudo, as quais, de acordo com os perfis de restrição do domínio V gerados por NheI, tinham tanto alelos rRNA 23S selvagens como mutados. O sequenciamento individual do domínio V das diferentes cópias do gene rRNA 23S mostrou G2576T em todas as cópias amplificadas por PCR: 4/4 e 5/5 em S. epidermidis e 3/3 em S. haemolyticus (CIMs de 16-32 µg/ml). A estabilidade da cópia rRNA 23S mutada foi observada mesmo em uma cepa S. epidermidis sensível à linezolida, a qual apresentou uma redução da CIM de 4 para 1 µg/ml mantendo seu único alelo mutado ao longo do processo de reversão ao fenótipo sensível. A similaridade genética foi determinada por PFGE e mostrou uma disseminação clonal das diferentes espécies de SCNs resistentes à linezolida. A análise das cepas de S. epidermidis por MLST mostrou a ocorrência do clone ST-2 (CC2) nos dois hospitais. O aumento da pressão seletiva devido a exposições cada vez mais frequentes à linezolida, provavelmente, favoreceu a seleção e a disseminação de clones endêmicos de SCNs com a mutação G2576T na instituição A desde 2008. De forma diferente, o uso mais restrito do fármaco na instituição B poderia explicar a ocorrência isolada de uma única cepa resistente desde 2005.
Title in English
Linezolid resistance in negative-coagulase staphylococci: characterization and stability of resistant phenotype
Keywords in English
Linezolid
Microbial drug resistance
Negative-coagulase staphylococci
Abstract in English
Linezolid was the first agent of the oxazolidinone class to be introduced clinically. This oxazolidinone inhibits protein biosynthesis by preventing the formation of the initiation complex that consists of the mRNA, the f-Met tRNA and the 50S subunit of the ribosome. Although linezolid resistance has been mediated by the cfr-encoded product or by ribosomal proteins (L3, L4 and L22), the most common mechanism of resistance involves mutations in the central loop of domain V of the 23S rRNA gene. From March 2008 to December 2011, 38 coagulase-negative staphylococci (CNS) strains (20 S. epidermidis, 14 S. haemolyticus, 3 S. hominis e 1 S. warneri) exhibiting resistance to linezolid were isolated from blood and catheter cultures from patients in two tertiary care hospitals in the State of São Paulo and were included in this study for the ascertainment of the resistance mechanisms to this antimicrobial agent and for the analysis of the stability of this resistance. The strains exhibited high-level resistance to linezolid (MICs 16-128 µg/ml) and all were multidrug resistant, remaining susceptible to vancomycin and teicoplanin. The G2576T mutation in domain V region of 23S rRNA was identified in all isolates, except in a linezolid-resistant S. haemolyticus strain. The cfr gene and mutations in ribosomal proteins L4 and L22 were not detected. Regarding L3 protein analysis, all S. epidermidis strains of hospital A, including the linezolid-susceptible control strain, showed the L3 Leu101Val mutation, suggesting that this alteration is probably not involved in linezolid resistance. The one strain from hospital B (S. epidermidis) was wild-type for this ribosomal protein. Only one S. haemolyticus strain had a mutation in the L3 protein, Val154Leu. Two S. hominis strains showed Gly139Arg/Met156Thr mutations whereas one strain had Phe147Ile in L3 protein. The identification of these mutations in L3 protein of the linezolid-resistant S. haemolyticus and S. hominis strains strengthens the role of these sites in the acquisition of linezolid resistance in Staphylococcus spp. However, the presence of G2576T in the 23S rRNA gene makes difficult to determine exactly the role of L3 mutations in conferring elevated linezolid MIC values showed by these clinical strains. In the absence of antibiotic pressure, after 130 passages, linezolid resistance was stable in the clinical strains of this study, which did not have all copies of the 23S rRNA gene mutated, according to the restriction of the domain V fragment with NheI enzyme. Sequencing of the individual copies of the 23S rRNA gene in the serially passaged strains showed G2576T in all amplified copies by PCR: 4/4 and 5/5 in S. epidermidis and 3/3 in S. haemolyticus strains (MIC of 16-32 µg/ml). The stability of the mutant rRNA copy was also observed in the linezolid-susceptible S. epidermidis strain (MIC of 4 µg/ml). After the passages in antibiotic-free medium, the linezolid MIC of this strain fell to 1 µg/ml and the G2576T mutation persisted in one 23S rRNA gene copy. The clonal relatedness of the strains was determined by PFGE and revealed a clonal dissemination of different CNS species. Regarding MLST analysis, all S. epidermidis strains belonged to the sequence type ST2 (CC2). Most likely, the increased selective pressure has contributed to the selection of endemic linezolid-resistant CNS clones showing the G2576T mutation that have been disseminated in the institution A since 2008. Differently, the restricted use of linezolid in the institution B could explain the occurrence of a single resistant strain since 2005.
 
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Publishing Date
2013-04-11
 
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