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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.87.2009.tde-13082009-093341
Documento
Autor
Nome completo
Marina von Atzingen dos Reis
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2009
Orientador
Banca examinadora
Nascimento, Ana Lucia Tabet Oller do (Presidente)
Martinez, Marina Baquerizo
Piazza, Roxane Maria Fontes
Silva, Aline Maria da
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski
Título em português
Expressão, purificação e caracterização de proteínas de superfície de Leptospira interrogans.
Palavras-chave em português
Bactérias
Biotecnologia
Genomas
Leptospira
Proteínas Recombinantes
Vacinas
Resumo em português
O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e ferramentas de bioinformática nos permitiram selecionar 15 genes que codificam proteínas hipotéticas conservadas preditas de superfície. A conservação foi confirmada por PCR em seis dos sorovares mais predominantes de L. interrogans. As proteínas recombinantes foram clonadas em vetor de expressão de E. coli em fusão com seis resíduos de histidina, que permite a purificação por cromatografia de afinidade a metal. Seis proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose. Através de um ensaio de adesão por ELISA, identificamos uma nova adesina de leptospira, Lsa21, que interage fortemente com laminina, colágeno IV e fibronectina plasmática. Usando a metodologia de Western blotting, identificamos mais nove possíveis adesinas. Nossos ensaios de desafio demonstraram que as proteínas rLIC12730 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Nossos dados sugerem que seja um promissor candidato na prevenção da leptospirose.
Título em inglês
Expression, purification and characterization of surface proteins from Leptospira interrogans.
Palavras-chave em inglês
Bacteria
Biotechnology
Genomes
Leptospira
Recombinant proteins
Vaccines
Resumo em inglês
The whole-genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni and the bioinformatic tools allow us to choose fifteen genes encoding for conserved hypothetical proteins predicted to be exported to the membrane. The chosen genes were amplified by PCR from six predominant pathogenic serovars, the DNA cloned in an E. coli vector, the recombinant proteins expressed in fusion with 6xHis-tag at N-terminus and purified by metal affinity chromatography. Six proteins were recognized by antibodies present in sera from human patients diagnosed with leptospirosis. By ELISA-attachment assay, we have identified a novel adhesion, named Lsa21, that binds strongly to laminin, collagen IV, and plasma fibronectin. By western blotting assay, we have further identified nine novel probable adhesions. The immunization/challenge assays showed that the recombinant protein rLIC12730 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Our data suggest that it is a promising candidate for prevention of leptospirosis.
 
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Data de Publicação
2009-08-26
 
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