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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.87.2009.tde-12082009-134731
Document
Author
Full name
Marcio Hideki Matsubara
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2009
Supervisor
Committee
Teixeira, Catarina de Fatima Pereira (President)
Azevedo, Inácio de Loiola Meirelles Junqueira de
Farsky, Sandra Helena Poliselli
Title in Portuguese
Efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus, da crotoxina e de suas subunidades fosfolipase A2 e crotapotina em monocamadas de células endoteliais em cultura.
Keywords in Portuguese
Crotalus durissus terrificus
Biotecnologia
Células endoteliais
Ciclooxigeneses
Fosfolipases A2
Prostaglandinas
Serpentes
Venenos
Abstract in Portuguese
O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e seus componentes desencadeiam importantes efeitos biológicos que envolvem direta e/ou indiretamente, componentes do sistema circulatório. Contudo, não há estudos específicos na literatura sobre os efeitos do veneno crotálico ou de suas toxinas, em células endoteliais. As células endoteliais constituem a camada de revestimento interna dos vasos sanguíneos, denominada endotélio. Este tecido é metabolicamente ativo, com função protetora do sistema cardiovascular e desempenha papel central na regulação da função circulatória, através do controle da coagulação, permeabilidade e do tônus vascular. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), do seu componente majoritário, a crotoxina (CTX) e de suas subunidades, fosfolipase A2 (CB) e crotapotina (CA), sobre células endoteliais, em cultura, quanto à: i) viabilidade e proliferação celular; ii) integridade das monocamadas; iii) produção de óxido nítrico, de prostaciclina e mecanismos envolvidos neste efeito. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus afetou a viabilidade e a integridade de células endoteliais em cultura, de modo tempo-dependente e apenas na maior concentração, sugerindo sua baixa toxicidade sobre as células endoteliais. A subunidade CB, mas não a CTX nem a crotapotina, reproduziu os efeitos causados pelo VCdt. Em concentrações não citotóxicas, tanto o veneno quanto as toxinas não alteraram a proliferação celular nem a produção basal de óxido nítrico pelas células endoteliais. Por outro lado, o veneno e a subunidade CB, mas não a CTX nem a CA causaram aumento significativo da produção de prostaciclina, via COX-1 e COX-2, sendo que a expressão protéica da isoforma COX-2 foi induzida por estes agentes. Além disso, foi demonstrado que a fosfolipase citosólica é relevante para o aumento da produção de prostaciclina, induzido pela CB. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade catalítica da subunidade CB é essencial para os efeitos descritos. Isto reforça a sugestão de que a subunidade fosfolipásica, isoladamente, possa contribuir para os efeitos do veneno total no endotélio. Nesse sentido, se houver alguma fração desta enzima na sua forma livre, no veneno total, sugere-se que ela contribua, de modo significativo, para os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus no endotélio.
Title in English
Effects of the venom of Crotalus durissus terrificus from crotoxina and its subunits and crotapotina phospholipase A2 in monolayers of endothelial cells in culture.
Keywords in English
Crotalus durissus terrificus
Biotechnology
Ciclooxigeneses
Endothelial cells
Phospholipase A2
Poison
Prostaglandins
Snakes
Abstract in English
Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) and their components induces systemic effects, which interfere with blood vessel system. Endothelial cells (EC) are central elements for haemostasis, regulating blood vessel-wall permeability, blood fluidity and adhesion properties of circulating leukocytes. However, there is no available data on the effects of this venom and its components on endothelial cells. In this study, the effects of CdtV, crotoxin (CTX) which is formed by two distinct subunits named crotapotin (CA) and phospholipase A2 (CB), on endothelial cells in vitro were investigated, analyzing EC viability and proliferation, EC monolayers integrity, release of both nitric oxide and prostacyclin (PGI2). CdtV, at the highest concentration, time-dependently decreased the viability of EC and the integrity of cell monolayers. The CB subunit, but not CTX nor CA, reproduced the effects caused by crude venom. In contrast, neither EC proliferation nor release of oxide nitric were affected by non-cytotoxic concentrations of CdtV or isolated toxins. However, at the same experimental condition, both CdtV and CB increased the prostacyclin release by endothelium through activation of COX-1 and -2 enzyme systems. Moreover, these toxins upregulated protein expression of COX-2 isoform, but did not alter constitutive expression of COX-1. On the other hand, neither CTX nor CA affected basal production of PGI2. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2) by AACOCF3 significantly reduced PGI2 increments caused by both CdtV and CB implying that cPLA2 cooperates for the synthesis of PGI2 induced by them. Inhibition of the catalytic activity of CB abrogated its ability to induce the release of PGI2, thus suggesting the importance of the phospholipase A2 enzyme activity for this effect. These findings provide evidence that CdtV and CB can directly activate EC and up-regulate cyclooxygenase pathways for production of prostacyclin, an important mediator of vasodilation and inflammation. Moreover, CB through its catalytic activity may significantly contribute for the stimulatory effect of CdtV in EC. Therefore, these findings indicate novel regulatory mechanisms for both CdtV and venom secretory PLA2 in endothelial cells.
 
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Publishing Date
2009-08-26
 
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