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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.87.2014.tde-05122014-134720
Documento
Autor
Nome completo
Alexandre Gonçalves de Rezende
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2014
Orientador
Banca examinadora
Jorge, Soraia Attie Calil (Presidente)
Mendonça, Ronaldo Zucatelli
Núñez, Eutimio Gustavo Fernández
Título em português
Avaliação da expressão gênica em células de mamíferos utilizando o Semliki Forest vírus.
Palavras-chave em português
Semliki Forest Vírus (SFV)
Cultura de células de mamíferos
Expressão de proteínas recombinantes
Glicoproteína do vírus rábico (RVGP)
Resumo em português
O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas.
Título em inglês
Evaluation of gene expression in mammalian cells using the Semliki Forest virus.
Palavras-chave em inglês
Semliki Forest Vírus (SFV)
Culture of mammalian cells
Expression of recombinant proteins
Rabies virus glycoprotein (RVGP)
Resumo em inglês
The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.
 
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Data de Publicação
2014-12-10
 
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