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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.85.2018.tde-28092018-142442
Documento
Autor
Nome completo
Felipe Douglas Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Soares, Carlos Roberto Jorge (Presidente)
Astray, Renato Mancini
Rodas, Andrea Cecilia Dorion
Título em português
Estudo dos perfis de N-glicosilação da prolactina recombinante humana expressa em células humanas HEK293
Palavras-chave em português
HEK293
MALDI-TOF-MS
perfil de N-glicanos
prolactina
transfecção transiente
Resumo em português
A prolactina humana (hPRL) é um hormônio sintetizado pela hipófise com inúmeras funções tais como: lactação, reprodução e regulação osmótica. Este hormônio é frequentemente dosado em casos de problemas na lactação, infertilidade, além de estudos que elucidam sua ligação em alguns tipos de câncer (mama, próstata e útero). A hPRL é encontrada na forma não glicosilada (NG-hPRL) (23 kDa) e glicosilada (G-hPRL) (25 kDa), sendo a isoforma glicosilada um modelo ideal de análise de perfil de N-glicanos, já que possui um único sítio de glicosilação localizado na Asparagina 31. A glicosilação está relacionada diretamente à solubilidade, à estabilidade, ao enovelamento, à meia-vida e atividade biológica in vivo. As células de ovário de hamster chinês (CHO) e as células embrionárias de rim humano (HEK293) são os hospedeiros mais utilizados para expressão de proteínas recombinantes, já que podem ser cultivadas em altas densidades e por possuírem similaridade nas modificações pós-traducionais. O objetivo foi expressar, purificar e realizar uma caracterização físico-química e biológica da hPRL glicosilada de células HEK293, incluindo análise da estrutura de carboidratos. Para tanto, foi realizada uma transfecção em células HEK293T (aderidas) com o vetor pcDNA 3.4-TOPO. Foi obtida uma expressão de 21,26 ± 8,3 μg/mL de hPRL no meio condicionado sem soro. A hPRL foi purificada por cromatografia de afinidade a metais imobilizados (IMAC), eluindo 92% da hPRL em uma única fração que, analisada por HPSEC, apresentou pureza de 97%. O perfil de N-glicanos da amostra apresentou seis espécies, todas com terminação em ácido-siálico, do tipo complexo, sendo bi, tri e tetra-antenárias, com relativa predominância da espécie N2G2S1 (29,4%). A bioatividade in vitro da G-hPRL HEK293 demonstrou ser ≅ 16 vezes menor que a G-hPRL produzida em células CHO.
Título em inglês
Study of N-glycosylate profiles of human recombinant prolactin expressed in human cells HEK293
Palavras-chave em inglês
HEK293 cells
MALDI-TOF-MS
N-glycoprofiling
prolactin
transient transfection
Resumo em inglês
Human prolactin (hPRL) is a hormone synthesized by the pituitary gland with innumerable functions such as lactation, reproduction and osmotic regulation. This hormone is often determined in cases of lactation problems, infertility, and studies that elucidate its connection in some types of cancer (breast, prostate and uterus). The hPRL is found in the non-glycosylated (NG-hPRL) (23 kDa) and glycosylated (G-hPRL) (25 kDa) form, being the glycosylated isoform an ideal model for N-glycan profile analysis, since it has a single glycosylation site located in Asparagine 31. Glycosylation is directly related to solubility, stability, folding, half-life and biological activity in vivo. Chinese hamster ovary (CHO) cells and human embryonic kidney (HEK293) cells are the most widely used hosts for expression of recombinant proteins, since they can be grown at high densities and have similarity in post-translational modifications. The objective of this work was to express, purify and perform a physicochemical and biological characterization of the glycosylated hPRL from HEK293 cells, including analysis of the carbohydrate structure. For this purpose, a transfection was performed on HEK293T (adhered) cells with the 3.4-TOPO pcDNA vector. Expression of 21.26 ± 8.3 μg/mL hPRL in the serum free conditioned medium was obtained. The hPRL was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC), eluting 92% of the hPRL in a single fraction which analyzed by HPSEC, showed 97% purity. The N-glycans profile of the sample showed six species, all with sialic acid termination, complex type, being bi, tri and tetra antennary, with a relative predominance of N2G2S1 (29.4%). In vitro bioactivity of G-hPRL HEK293 demonstrated to be ≅ 16-fold lower than G-hPRL produced in CHO cells.
 
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2018SilvaEstudo.pdf (1.89 Mbytes)
Data de Publicação
2018-11-12
 
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