• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.85.2009.tde-22092011-093547
Document
Auteur
Nom complet
Fernanda Bernardes Calvo
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2009
Directeur
Jury
Marumo, Maria Helena Bellini (Président)
Braga, Patricia Cristina Baleeiro Beltrao
Maria, Durvanei Augusto
Titre en portugais
Construção e caracterização in vitro  de um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 para utilização em terapia gênica
Mots-clés en portugais
endostatina
interleucina-2
terapia gênica
vetor retroviral
Resumé en portugais
A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada. Vetores bicistrônicos são uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. Na construção de um vetor bicistrônico pode-se empregar várias estratégias dentre elas a utilização da sequência IRES. A endostatina, fragmento do colágeno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiogênica devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequência IRES. A construção do vetor foi realizada em três etapas, sendo comprovada a construção final por análise de restrição e seqüenciamento. Células de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdução na célula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de análise da expressão por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor construído apresentou altos níveis de titulação viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determinação da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89μg/106cels.24h, respectivamente. A expressão da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior á apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibição da proliferação de 40% das células endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma proliferação de 10.6% de linfócitos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a construção obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do câncer e novas estratégias terapêuticas.
Titre en anglais
Construction and chracterization in vitro of a bicistronic retroviral vector coding endostatin and interleukin-2 for use in gene therapy
Mots-clés en anglais
endostatin
gene therapy
interleukin-2
retroviral vector
Resumé en anglais
Gene therapy has been used in preclinical studies and clinical trials in order to alleviate or cure a disease. Retroviral vectors are a tool for gene transfer is widely used. Bicistronic vectors are an attractive alternative for treatment of complex diseases. A variety of options exists to simultaneously express two genes in genetically modified cells. The most common approach relies on bicistronic vectors in which the genes are linked to each other by an internal ribosome entry site allowing co-translational expression of both cistrons. Endostatin, the C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent angiogenesis inhibitor. At present, ES has been widely used in anti-angiogenic in a variety of experimental tumor models, and clinical trials to test it as an anti-tumor agent are already under way. Immunotherapy has been used as adjuvant treatment for tumors and has been used in several preclinical studies and clinical trials. The objective of this project was to construct and characterize in vitro an IRES-based bicistronic retroviral vector encoding endostatin and intereukin-2. The construction of the vector was performed in three stages, the final construction was analyzed by restriction analysis and sequencing. Packaging cells were prepared. The endostatin and interleukin-2 levels were determined by Dot blot. Monocistronic and bicistronic mRNA expression were analyzed by real time RT-PCR. Bicistronic vector showed high levels of virus trites, ranging from 4.20x105 to 1.53x106UFC/mL. Secreted levels of endostatin and interleukin-2 ranged from 1.08 to 2.08μg/106cells.24h and 0.66 - 0.89g/106cells.24h, respectively. The mRNA expression of ES in the NIH3T3 clone pLend-IRES-IL2SN was 2 times higher than the level presented by the NIH3T3 clone pLendSN. The endostatin promoted inhibition (40%) of endothelial cell proliferation. Interleukin-2 promoted a proliferation of 10.6% lymphocytes CD4 and 8.9% of CD8. We conclude that the IRES bicistronic vector provides a powerful tool for studies of cell biology of cancer and new therapeutic strategies.
 
AVERTISSEMENT - Regarde ce document est soumise à votre acceptation des conditions d'utilisation suivantes:
Ce document est uniquement à des fins privées pour la recherche et l'enseignement. Reproduction à des fins commerciales est interdite. Cette droits couvrent l'ensemble des données sur ce document ainsi que son contenu. Toute utilisation ou de copie de ce document, en totalité ou en partie, doit inclure le nom de l'auteur.
Date de Publication
2011-10-17
 
AVERTISSEMENT: Apprenez ce que sont des œvres dérivées cliquant ici.
Tous droits de la thèse/dissertation appartiennent aux auteurs
CeTI-SC/STI
Bibliothèque Numérique de Thèses et Mémoires de l'USP. Copyright © 2001-2024. Tous droits réservés.