• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.85.2015.tde-19102015-150711
Documento
Autor
Nome completo
Fernanda dos Santos Arthuso Perez
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2015
Orientador
Banca examinadora
Soares, Carlos Roberto Jorge (Presidente)
Affonso, Regina
Magalhães, Geraldo Santana
Novo, Juliana Branco
Oliveira, João Ezequiel de
Título em português
Influência da temperatura de cultivo na expressão de proteínas recombinantes de interesse terapêutico no espaço periplásmico bacteriano, utilizando o promotor lambda PL
Palavras-chave em português
antagonistas
Escherichia coli
hormônio do crescimento
interferon
prolactina
Resumo em português
O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor λPL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon α2a (IFN-α2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-α2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH.
Título em inglês
Influence of the cultivation temperature on the expression of recombinant proteins of therapeutic interest in the periplasmic space, using lambda PL promoter
Palavras-chave em inglês
antagonist
Escherichia coli
growth hormone
interferon
prolactin
Resumo em inglês
The expression system based on the PL or PR promoters of the lambda phage that is usually regulated by the term labile repressor (clts) is widely used to produce recombinant proteins in prokaryotic cells. However, the temperature increase required in this system to promote the repressor inactivation shows some limitations, like the increase of the HSP (Heat Shock Proteins) proteins expression, proteases e.g., that depending on the nature of the expressed protein can be harmful or not. Another limitation is the activation of SOS response, resulting on the stop of the DNA cell replication or depending on the strain can occur cell lysis. In this paper we describe the use of the λPL promoter for constitutive expression, without the repressor regulation. We optimized different cultivation conditions to increase the secretion in the periplasmic space of Escherichia coli of five proteins: the human growth hormone (hGH), that is being widely used in the treatment of children with disabilities and/or resistance to hGH, Turner syndrome, within another disorders; human prolactin (hPRL), a polypeptide hormone known for stimulating the lactation and for exercising regulatory action on growth and on the differentiation of the mammary gland; two hPRL antagonists, studied as potential medicine to the treatment of some kinds of cancers and finally the interferon α2a (IFN-α2a), that is a cytokine produced by the cells, in response to different actions, including viral nucleic acids, neoplastic cells, antigens of bacteria, protozoa and viruses. In the case of IFN-α2a, this high value added and important therapeutic application, was developed in our laboratory as a part of this paper, including the development and the validation of the analysis methodology by reversed-phase HPLC to determine the IFN present in the bacterial periplasmic fluid or in its pure form. The main strategies used to improve the expression were to start the induction with the maximum optical density of bacterial growth and optimize the induction temperature to control the expression of heterologous protein. This methodology can be used in cases where the product wont be toxic to the host cell or when the instability of the plasmid is not a problem. The possibility of cultivation in lower temperatures, since the heat-sensitive repressor is not present, contributed to the significant increase of the expression, even to proteins that are less sensitive to the cultivation temperature, like the hGH.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2015-10-28
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2018. Todos os direitos reservados.