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Dissertação de Mestrado
Documento
Autor
Nome completo
Paulo Victor Sarmento Dias
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2017
Orientador
Banca examinadora
Soares, Carlos Roberto Jorge (Presidente)
Dalmora, Sergio Luiz
Magalhães, Geraldo Santana
Título em português
Desenvolvimento de processo de produção e caracterização de interferon-α2a secretado no espaço periplásmico de Escherichia Coli
Palavras-chave em português
Escherichia Coli
interferon
produção
purificação
recombinante
Resumo em português
Os IFN-α2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-α2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-α2a e interferon-α2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 μg (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 μg de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-α2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 μg/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa.
Título em inglês
Development of production process and characterization of periplasmic interferon-α2a expressed in Escherichia Coli
Palavras-chave em inglês
Escherichia Coli
interferon
production
purification
recombinant
Resumo em inglês
IFN-α2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi's sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-α2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-α2a and interferon-α2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 μg (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p<0.0001), for a range of analyzed interferon mass from 0,62 to 10 μg. This rapid methodology allows the application of the RP-HPLC as a powerful tool to monitor the production yield and quality of periplasmic Interferon α2 right after, or even during the fermentation. The optimum expression temperature was evaluated in flask cultures from 30 to 42 °C. It was observed that the volumetric and specific production were higher for culture temperatures equal or above 35 °C. Thus, considering the potential recombinant protein degradation induced by temperature, 35 °C was well-marked as the optimum temperature for interferon expression. The higher values for specific and volumetric production in culture flasks were 1.04 μg/mL/A600 and 3.45 mg/L respectively. As purification method, it was utilized ionic chromatography followed by size-exclusion chromatography. The final purity and mass recovery was, respectively, 95.3 % and 66 %. The final product was also characterized utilizing SDS-PAGE, western blotting, reversed-phase HPLC, size-exclusion HPLC and mass spectrometry analysis.
 
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Data de Publicação
2017-12-04
 
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