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Dissertação de Mestrado
Documento
Autor
Nome completo
Gabriel Belem de Andrade
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2017
Orientador
Banca examinadora
Navarro, Marcos Vicente de Albuquerque Salles (Presidente)
Ambrósio, André Luís Berteli
Borges, Lisandra Marques Gava
Título em português
Estudos estruturais de dockerinas e cohesinas em Ruminococcus flavefaciens e sua aplicação no desenvolvimento de matrizes auto montáveis de proteínas
Palavras-chave em português
Ruminococcus flavefaciens
Cohesina
Dockerina
Redes automontáveis Nanomaterial
Resumo em português
O celulossomo é um complexo multienzimático extracelular utilizado por bactérias anaeróbias para a degradação de biomassa vegetal. Ele é composto por escafoldinas, estruturas alongadas que abrigam diversos módulos cohesina, às quais se ligam dockerinas, seus parceiros de interação específica de alta afinidade, fusionados às enzimas celulolíticas. Os módulos cohesina e dockerina compõem o elemento central da interação entre todos os componentes que integram o celulossomo. Esses módulos são divididos em tipos, de acordo com sua sequência primária. Essa divisão reflete efeitos funcionais distintos, sendo o tipo I responsável pela ligação de enzimas às escafoldinas, enquanto o tipo II medeia a ligação de escafoldinas à célula. O celulossomo de Ruminococcus flavefaciens é o mais complexo conhecido, e na classificação por tipos, suas sequências divergem, formando o tipo III, que foi posteriormente subdividido em 6 grupos para significância funcional. Nesse sistema, o principal responsável pela integração de enzimas ao sistema é a escafoldina primária ScaA, a qual interage com escafoldina adaptadora ScaB. A especificidade dessa ligação - dockerina de ScaA (Rf-DocA) com cohesinas de ScaB (Rf-CohB1-7) - é classificada como único membro do grupo 5, na divisão de grupos que compõem o tipo III. Assim, essa interação é de suma importância para a organização do celulossomo desse organismo, tendo sido estudada por meio de experimentos biofísicos e bioquímicos. Porém a falta de uma estrutura cristalina resolvida desses componentes limita a compreensão que podemos ter sobre a interação. 1-2 Nesse trabalho, apresentamos as estruturas cristalográficas de Rf-DocA, em complexo com a Rf-CohB4, além da estrutura dessa cohesina isolada, e ainda, a Rf-CohB1, e alguns de seus mutantes pontuais. Com isso, esclarecemos aspectos estruturais desses módulos, como a presença de dois sítios funcionais de ligação a cálcio em Rf-DocA. Também é observável pelos modelos gerados, detalhes da ligação entre eles, como os resíduos participantes da interação. Estudos de afinidade entre esses módulos foram conduzidos para a elucidar algumas propriedades da ligação entre esses módulos, de forma que descobrimos que ela ocorre de uma única maneira, e que há um loop na cohesina cuja flexibilidade afeta a afinidade da ligação. Isso sugere um mecanismo de alteração conformacional que regula a ligação à dockerina. Adicionalmente, buscamos o emprego desses módulos em uma aplicação tecnológica, desenhando redes automontáveis de proteínas, visando a construção de um nanomaterial. Essas redes são formadas por características intrínsecas das proteínas que os compõem, sendo o principal fator considerado sua simetria rotacional.3 Nesse sentido, as dockerinas e cohesinas foram utilizadas para ligação entre proteínas de diferentes simetrias. Utilizamos proteínas de simetrias C3, C4 e C6 com fusão a dockerinas, que se conectam às cohesinas fusionadas a proteínas de simetria C2, as quais formam o elemento linear da ligação entre os diferentes módulos. Esse desenho experimental permite a expressão e purificação independentes dos componentes, o que facilita a obtenção das redes, a partir da mistura dos dois componentes. Através de análises preliminares por microscopia eletrônica de transmissão, observamos a formação de filmes bidimensionais extensos e nanotubos com a construção testada.
Título em inglês
Structural studies of dockerins and cohesins of Ruminococcus flavefaciens and their application in self-assembling arrays of proteins
Palavras-chave em inglês
Ruminococcus flavefaciens
Cohesin
Dockerin
Nanomaterial
Self-assembling arrays
Resumo em inglês
The cellulosome is an intricate multienzyme extracelular complexes evolved by anaerobic bacteria for degradation of cellulosic biomass. It is composed of scaffoldins, elongated structures, which bare numerous cohesin modules, which bind to dockerin modules, their high affinity and specificity partners, borne by cellulolytic enzymes. The cohesin and dockerina modules constitute the central element of the interaction between every component of the cellulosome. These modules are categorized in types, according to their primary sequence. That distribution reflects distinct functions, in which the type I is responsible for integration of enzymes to scaffoldins, while type II mediates anchoring of scaffoldins to the cell wall. The cellulosome of Ruminococcus flavefaciens is the most intricate known to date, which is categorized into a third type of cohesins and dockerins, due to sequence diversion. The type III was further divided into 6 groups to impart functional significance. In that system, the main enzyme integrating component is the primary scaffoldin ScaA, which interacts to the adaptor scaffoldin ScaB. The specificity of this interaction - dockerina of ScaA (Rf-DocA) to ScaB cohesins (Rf-CohB1-7) - is sorted as a single member of group 5, in the subtypes of type III. Thus, this interaction is essential for cellulosome organization, having been studied by biophysical and biochemical experiments. However, the lack of a solved crystalline structure of these components narrows our understanding on this interaction. In the present study, we present the structures of Rf-DocA, complexed to Rf-CohB4, besides the structure of this isolated cohesin, and also Rf-CohB1 and its point mutants. Due to these data, we clarify structural aspects of these modules, such as the occurrence of two functioning calcium binding sites in Rf-DocA. We also identified details of their binding, such as the interacting residues. Through binding affinity studies, we concluded that the interaction between these modules occurs in a single mode, and that there is a loop in the cohesin module whose flexibility has direct effects on the binding affinity to dockerin. Additionally, we sought to utilize these modules in a downstream application, by designing self-assembling arrays of proteins, aiming for the construction of a nanomaterial. These arrays are constructed from the intrinsic properties of its constituent proteins, in which the main factor is rotational symmetry. In this context, dockerina and cohesin modules were used of binding different symmetry proteins. We utilized C3, C4 and C6 point symmetry proteins fused to dockerin modules, which bind to the cohesin modules fused to C2 point symmetry proteins, which establish the linear connection between the distinct components. This experimental design allows for the independent expression and purification of the components, which facilitates the achievement of the arrays, by simple mixture of the two components. Through preliminary analysis by transmission election microscopy, we observed the construction of two-dimensional films and nanotubes.
 
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Data de Publicação
2017-10-02
 
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