A enzima Glucosamina-6-fosfato desaminase (GlcN6P desaminase) é envolvida na conversão reversível da D-glucosamina-6-fosfato (GlcN6P) em Fru6P e amônia, como parte do caminho metabólico de aminoaçúcares como fonte de energia celular. A enzima hexamérica (peso mol. 178200) exibe uma cooperatividade homotrópica intensa em direção à GlcN6P a qual é modulada alostericamente pelo ativador N-acetil-D-glucosamina 6-fosfato (GlcNAc6P). A GlcN6P desaminase foi cristalizada no grupo espacial R32, com parâmetros de rede a = b = 125.9 Å e c = 223.2 Å e um conjunto de dados à 2.1 Å de resolução foi coletado usando radiação de luz síncrotron (Horjales et ai., 1992). A procura no banco de dados de seqüências OWL não mostrou homologia significante com qualquer outra família de proteína, desta maneira a determinação da estrutura foi feita pela técnica de substituição isomórfica múltipla (MIR) a partir de dois derivados, um composto de platina, o K₂PtCl₄ e um complexo de mercúrio, o ácido mersálico. O mapa MIR a 3 Å de resolução mostrou contornos claros e utilizando técnicas de nivelamento de solvente (solvent flattening) estendeu-se as fases até 2.5 Å. A enzima cristaliza-se com dois monômeros na unidade assimétrica. A densidade eletrônica final foi interpretada com o auxílio do programa gráfico 'O', sendo possível determinar sem ambigüidade 230 dos 266 resíduos de cada monômero; a partir daí foram usados subseqüentes mapas de Fourier diferença para a localização de todos os outros resíduos. O refinamento do modelo foi feito utilizando o programa X-PLOR (Brünger, 1993), usando a rotina simulated annealing, obtendo o fator R final de 17.4% com 348 moléculas de água e quatro íons inorgânicos de fosfato. O enovelamento do monômero tem uma estrutura do tipo α/β com uma folha-β pregueada paralela central com sete fitas com topologia 4x, 1x, 1x, -3x, -1x, -1x, envolvida por ambos os lados por oito hélices-α e uma hélice 3₁₀ com duas voltas. A sexta fita da folha-β central tem um prolongamento no C-terminal que faz parte de uma segunda folha-β antiparalela de três fitas com topologia 2, -1. O hexâmero tem uma simetria local 32, com dois trímeros empacotados frente-a-frente com uma rotação relativa de 15° em tomo do eixo de ordem 3 e ligados por pontes salinas e algumas interações hidrofóbicas em tomo do eixo não cristalográfico de ordem 2. As moléculas de cada trímero formam um contato não usual de três resíduos Cis 219 próximo ao eixo de ordem três. Os complexos com ativador alostérico (GlcNAc6P) e inibidor competitivo (2-desoxi 2-amino glucitol 6-fosfato) foram co-cristalizados isomorficamente com a estrutura nativa. Os mapas Fourier diferença mostram claramente densidades para os ligantes, definindo sem ambigüidade o sítio ativo e alostérico. O refinamento dos complexos produziu a mesma conformação da proteína nativa, na margem de erro experimental. Os sítios alostéricos (seis) estão localizados na interface adjacente dos monômeros de cada trímero e os sítios ativos (ou catalíticos) no lado externo de cada monômero, no C-terminal da folha-β central. O monômero tem uma topologia com enovelamento similar a um domínio de ligação de NAD, excluindo os segmentos de aminoácidos 1-35, 145-188 e 243-266. As estruturas dos complexos e da nativa estão em um estado alostérico R em concordância com o modelo MWC para um sistema do tipo K (Monod et al, 1965). Um mecanismo alostérico similar ao da GlcN6P desaminase é encontrado na enzima fosfofrutoquinase (Evans, 1981). Um mecanismo catalítico é proposto para a reação de isomerisação-desaminação da enzima GlcN6P desaminase a partir do mecanismo geral para aldose-cetona isomerases.

The enzyme Glucosamine-6-phosphate deaminase (GlcN6P deaminase) is involved in the reversible conversion of D-glucosamine-6-phosphate (GlcN6P) into Fru6P and ammonia. The hexameric enzyme (mol.wt.=178200) exhibits an intense homotropic co-operativity towards GlcN6P which is allosterically modulated by the activator N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate (GlcNAc6P). The GlcN6P deaminase was crystallized in space group R32, with cell parameters a=b= 125.9 Å and c = 223.2 Å and a native dataset was collected to 2.1 Å resolution at a synchrotron source (Horjales et al, 1992). A search of the OWL sequences database has shown no significant homology with any other known protein family. Therefore, the structure determination will have to be achieved through the Multiple Isomorphous Replacement technique from two isomorphous derivatives, a platinum compound K₂PtCl₄ and a mercury complex, mersalyl acid. The MIR map at 3 Å resolution showed clear molecular boundaries and solvent flattening techniques (Wang, 1985) were used to extend the phase set to 2.5 Å. The final electron density map was interpreted with the aid of the graphic program 'O'. The enzyme crystallizes with a dimmer in the asymmetric unit and 230 out of the total 266 residues of each crystallographically independent monomer could be unambiguously identified in the map. The remaining residues were located after subsequent difference Fourier maps. The refinement was made with program X-PLOR (Brunger, 1993), using the simulated annealing routine, obtained R=17.4 % with 348 water molecules and four inorganic phosphate ions. The monomer fold shows an α/β structure with a central 7-stranded β-sheet with topology 4x, 1x, 1x, -3x, -1x, -1x, surrounded on both sides by eight α-helices and 2-turn 3₁₀ -helix. The sixth strand of the central β-sheet is common to a second 3-stranded anti-parallel β-sheet with topology 2, -1. The hexamer has local 32 symmetry, with two trimmers packed in a face-to-face arrangement with a relative rotation of 15° around the 3-fold axis, and linked together by salt-bridge and some hydrophobic contacts. The molecules of each trimmer have extensive contacts and show an unusual feature of the three Cys219 residues closely clustered around the 3-fold axis. The complexes with allosteric activator (GlcNAc6P) and inhibitor (2-deoxy-2-amino glucitol 6-phosphate) were co-crystallized isomorphously with the native structure. The difference Fourier maps shows clear density for the ligands, unambiguously defining the active and allosteric sites. The complexes refinement produced the same conformation of the native, within experimental error. The allosteric sites are located at the interfaces of adjacent monomers from each trimer and the active sites (or catalytic) lie at the external side of each monomer, at the C-terminal end of the central parallel β-sheet. The monomer has a similar folding topology as a typical NAD binding domain, excluding the segments of aminoacids 135, 145-188 and 243-266. The native and complexes structures are at the allosteric state R concerted with MWC model for a K-system (Monod et al, 1965). A similar allosteric mechanism is found in the enzyme phosphofructokinase (Evans, 1981). A catalytic mechanism is proposed for the isomerisation-deamination reaction of the enzyme from general mechanism for aldo-keto isomerases.