A microscopia de fluorescência é uma das técnicas mais poderosas disponíveis atualmente, uma vez que proporciona uma combinação excepcional de alta sensibilidade na detecção, alta especificidade, além de ser consideravelmente não invasiva. Avanços recentes permitiram a detecção em resolução de subdifração, o que eleva sua potencialidade de investigação de um maior número de sistemas e, consequentemente, de avanço científico.

O estudo de novas sondas fluorescentes é de fundamental importância para a aplicação em métodos avançados de microscopia óptica. Na primeira vertente da pesquisa, Capítulo 2, foi realizado o estudo fotofísico de uma série de compostos bisarilados derivados do anidrido maleico e de maleimidas sintetizados pela reação de Heck-Matsuda. Visando o aprimoramento do design dessas moléculas, foi realizada a ciclização fotoquímica de tais compostos, resultando em moléculas com anéis condensados, nomeados como derivados de fenantreno, as quais proporcionaram maior estabilidade fotoquímica. A dinâmica do estado excitado remete ao efeito push-pull, em que há um deslocamento de carga notável, mas não completo. Para os compostos com a substituição 4-hidroxifenil foi observado um processo de deslocamento de carga combinado com uma transferência de próton no estado excitado assistida por solvente. Ademais, o estudo dos compostos derivados de fenantreno em microscopia confocal demonstrou que as propriedades locais do solvente afetam a dinâmica de relaxação de fluorescência em diferentes meios condensados e que os mesmos são passíveis de serem aplicados a técnicas avançadas de microscopia de fluorescência.

A segunda vertente desta tese, Capítulo 3, explora um sistema biológico em nível de uma única molécula. Especificamente, este capítulo concerne à investigação de uma metodologia ótima para a marcação fluorescente de DNA em sequência específica, através de microscopia de fluorescência com super-resolução. As reações foram conduzidas utilizando uma metodologia de marcação de duas etapas, de acordo com o princípio mTAG. Na primeira etapa, grupamentos contendo alquino terminal, azida ou amina primária são transferidos do cofator análogo ao S-adenosil-L-metionina para o DNA através de uma enzima metiltransferase. Foi utilizada a enzima M.TaqI, a qual tem como alvo a sequência 5'- TGCA -3' para modificação. Na segunda etapa é realizado o acoplamento do fluoróforo aos sítios funcionais do plasmídeo (pUC19) através de reações químicas bioortogonais, tais como reação click catalisada por cobre (CuAAC), reação click na ausência de cobre (SPAAC) e acoplamento do grupo amina primária com NHS-éster. Também foi desenvolvida uma metodologia direta de uma etapa, na qual o fluoróforo é diretamente transferido do cofator análogo para o DNA em uma única etapa reacional.

Para acompanhar o desempenho das reações foi desenvolvido um ensaio single-molecule para a contagem do número de moléculas de corante ligadas a plasmídeos individuais. A topologia dos plasmídeos após a marcação foi investigada por imagens de AFM em alta resolução. A combinação de ambas as análises demonstrou que a reação SPAAC assim como a reação direta de uma etapa promoveram uma marcação fluorescente quase completa e a técnica de AFM confirmou que o acoplamento de fluoróforos não induziu danos à estrutura dos plasmídeos, os quais preservaram sua morfologia nativa, superenrolada. Além disso, os plasmídeos marcados foram aplicados com sucesso a procedimentos de transfecção em células de mamíferos, indicando que o DNA reteve sua capacidade de codificar informação genética, mesmo na presença de fluoróforos ligados.

Fluorescence microscopy is one of the most powerful techniques currently available, since it provides the unique combination of a high sensitivity in detection, a high specificity, and a considerable non-invasiveness. Recent developments have allowed the detection at a sub-diffraction resolution, which elevates its potentiality to investigate several systems and hence to go further in science.

The study of new fluorescent probes is crucial for the application in advanced methods in optical microscopy. In the first extent of this research, Chapter 2, a photophysical study of maleic anhydride and maleimide derivatives, synthesized by the Heck-Matsuda reaction, was performed. Aiming at the improvement of the design of these molecules, a photochemical cyclization was carried out, resulting in molecules with condensed rings, termed as phenanthrene derivatives, which promoted more photochemical stability. The excited state dynamics rely on the push-pull effect, in which a notable, but not complete, charge shift takes place. For the compounds with a 4-hydroxyl substituent, a charge shift combined with an excited state solvent-assisted proton transfer was observed. Additionally, the confocal microscopy study of the phenanthrene derivatives showed that the local properties of the solvent modulate the fluorescence relaxation dynamics in condensed media and hence such dyes can be potential candidates for use in advanced fluorescence microscopy techniques.

The second extent of this thesis, Chapter 3, explores a biological system at the single-molecule level. Specifically, this chapter concerns to an investigation of an optimal sequence-specific DNA fluorescent labelling, using super-resolution fluorescence microscopy. The reactions were performed using a two-step methodology, according to the mTAG approach. In the first step, moieties containing a terminal alkyne, azide, or primary amine group are transferred from an S-adenosyl-L-methionine analogue cofactor to the DNA by a methyltransferase enzyme. Herein, the enzyme M.TaqI was used, which targets the 5'- TCGA -3' sequence for modification. In the second step, a fluorophore is coupled to the functional sites of the plasmid (pUC19) using bio orthogonal reactions, such as the click reaction catalysed by copper (CuAAC), the copper-free click reaction (SPAAC), and the amino-to-NHS-ester coupling reaction. A direct one-step approach in which the fluorophore is directly transferred to the DNA from the analogue cofactor in a single reaction step, was also developed.

A single-molecule assay was developed for counting the number of fluorophores associated with the individual plasmids. The topology of the plasmids after labelling was also investigated by high-resolution AFM imaging. Combining both analysis, the SPAAC as well as the direct one-step reactions were found to promote near-complete labelling and the AFM showed that the fluorophore coupling did not damage the structure of the plasmids and that their native, supercoiled, morphology was preserved. Moreover, labelled plasmids were successfully applied for transfection into mammalian cells, implying that the DNA retained its ability to encode genetic information, even while carrying bound fluorophores.