• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.75.2018.tde-10102018-162854
Documento
Autor
Nome completo
Sergio Luiz Ramos Junior
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2018
Orientador
Banca examinadora
Borges, Júlio César (Presidente)
Bertolini, Maria Celia
Canduri, Fernanda
Navarro, Marcos Vicente de Albuquerque Salles
Título em português
Caracterização da chaperona Hsp100 de Leishmania braziliensis: estudos estruturais e funcionais
Palavras-chave em português
chaperona
Hsp100
leishmaniose
Resumo em português

A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada que afeta milhares de pessoas podendo até levar a óbito em sua forma visceral. Durante o seu ciclo de vida, o parasita passa por diversas mudanças ambientais como mudança de temperatura e pH, principalmente quando da transfecção do inseto vetor para o hospedeiro mamífero. Tais mudanças geram estresse celular que pode levar proteínas ao enovelamento incorreto assim como a processos agregativos, sendo necessários sistemas de controle de qualidade proteico para manter a homeostase celular, do qual fazem parte as chaperonas moleculares. Chaperonas como a Hsp100, ajudam a manter a homeostase celular e a adaptação desempenhando um papel importante para protozoários como a Leishmania braziliensis, causador da leishmaniose. A Hsp100 tem papel desagregase, atuando com outras chaperonas moleculares para a extração de polipeptídios de agregados proteicos possibilitando seu desenovelamento e posterior reenovelamento, evitando seu efeito tóxico sobre a célula. A Hsp100 parece ser essencial para esses microrganismos, no entanto não há muito dados disponíveis para Hsp100 em Leishmania sp. e Plasmodium sp. Neste trabalho está descrito o protocolo para expressão e purificação da Hsp100 recombinante de L. braziliensis (rLbHsp100), assim como sua caracterização estrutural e funcional inicial in vitro. A proteína foi analisada por espectropolarimetria de dicroísmo circular, apresentando estrutura típica de proteínas ricas em hélices α, a fluorescência estática de triptofano demonstrou que a proteína possui estrutura terciária local com seus triptofanos parcialmente expostos ao solvente. Por cromatografia de exclusão molecular analítica, observou-se que a LbHsp100 se comporta como um oligômero cujo estado é influenciado tanto pela concentração proteica como pela presença de nucleotídeos adenosina. Análises por ultracentrifugação analítica evidenciaram que a rLbHsp100 em solução apresenta um equilíbrio de diversas espécies havendo deslocamento para um hexâmero de maneira concentração dependente. Análises de SAXS confirmaram a estrutura hexamérica e proporcionaram a obtenção de um modelo ab initio da proteína. Através de microscopia eletrônica de transmissão pode-se observar a forma toróide e a dispersividade do sistema. Por fim, atestou-se que a proteína foi obtida funcional com fraca atividade ATPásica, apresentando também interações com nucleotídeos adenosina (ATP e ADP) assim como com a suramina.

Título em inglês
Characterization of the Hsp100 chaperone of Leishmania braziliensis: structural and functional studies
Palavras-chave em inglês
chaperone
Hsp100
leishmaniasis
Resumo em inglês

Leishmaniasis is a neglected tropical disease that affects thousands of people and may even lead to death in its visceral form. During its life cycle, the parasite undergoes several environmental changes such as temperature and pH changes, especially when transfecting from the vector insect into the mammalian host. Such changes generate a cellular stress that can lead to misfolding as well as to aggregative processes, therefore a protein quality control system is necessary to maintain cell homeostasis, which includes molecular chaperones. Chaperones such as Hsp100 can help maintain cellular homeostasis and adaptation playing an important role for protozoa such as Leishmania braziliensis, which causes leishmaniasis. The Hsp100 has a disaggregase action, acting with other proteins of the chaperone system to extract polypeptides from protein aggregates, allowing their unfolding and subsequent refolding, avoiding their toxic effect on the cell. Hsp100 appears to be essential for these microorganisms, however there is not much data available for Hsp100 in Leishmania sp. and Plasmodium sp. This work describes the protocol for expression and purification of the recombinant Hsp100 of Leishmania braziliensis (rLbHsp100), as well as its initial in vitro characterization. The protein was analyzed by circular dichroism spectropolarimetry, presenting a typical structure of ?-helix rich protein as well as a concentration-dependent structure gain, static fluorescence of tryptophan demonstrated that the protein has local tertiary structure with its tryptophans partially exposed to the solvent. Analytical size exclusion chromatography showed that LbHsp100 behaves as an oligomer whose state is influenced by both the concentration and the presence of adenosine nucleotides. Analysis by analytical ultracentrifugation has shown that the rLbHsp100 in solution exhibits an equilibrium of several species shifting towards a hexamer in a concentration dependent manner. SAXS analyzes confirm the hexameric structure and had provide an ab initio model for the protein. Transmission electron microscopy shows the toroidal form and dispersivity of the system. Finally, the obtained protein had showed catalytic function, and also interacted with adenosine nucleotides (ATP and ADP) as well as suramine.

 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2018-10-16
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
CeTI-SC/STI
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2018. Todos os direitos reservados.