A Leishmaniose é uma doença infecciosa causada por protozoários flagelados do gênero Leishmania. Os parasitas como a Leishmania braziliensis, sofrem várias mudanças morfológicas durante seu ciclo de vida, incluindo a troca de organismo hospedeiro. Durante essas mudanças, proteínas de choque térmico ou chaperones moleculares, como, por exemplo, a Hsp70, são expressas em grande quantidade. A função da Hsp70 é auxiliar no processo de enovelamento protéico, no transporte de proteínas entre as membranas e em muitas outras importantes funções celulares. A Hsp70 é auxiliada por várias proteínas denominadas como co-chaperone e a Hep1 (do inglês Hsp70-escort protein 1) é uma delas. Essa co-chaperone tem seu papel descrito principalmente em mitocôndrias como estabilizadoras da Hsp70 capazes de prevenir a sua agregação. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar, purificar e caracterizar as proteínas Hsp70 e Hep1 de L. braziliensis (LbHsp70 e LbHep1). Os ensaios preliminares mostraram que a LbHsp70 foi expressa de forma insolúvel, sendo necessário expressar a proteína em corpos de inclusão para tentativas de reenovelamento, afim de obter a mesma na fração solúvel. Apesar da LbHsp70 se apresentar na fração solúvel após o reenovelamento, a mesma foi purificada como agregado. Ainda na tentativa de obter a LbHsp70 na forma solúvel, a mesma foi co-expressa com a LbHep1 (expressa na forma solúvel), porém a LbHsp70 continuou na fração insolúvel do lisado bacteriano. Como a LbHep1 não apresentou a atividade esperada quando co-expressa com a LbHsp70 citoplasmática, foram feitos ensaios de co-expressão da LbHep1 com a Hsp70 mitocondrial humana, que é heterologamente expressa na forma de agregados, com o intuito de confirmar a atividade estabilizadora das Hep1 sobre as Hsp70 mitocondriais. Este experimento possibilitou a obtenção de ambas proteínas na fração solúvel, de acordo com dados apresentados na literatura para este sistema em outros organismos. Uma vez mostrada à funcionalidade da LbHep1, foi feita a caracterização desta proteína por métodos biofísicos como dicroísmo circular, espectrometria de fluorescência, cromatografia de exclusão molecular analítica e ultracentrifugação analítica. Os experimentos mostraram que a LbHep1 apresenta estrutura secundária composta principalmente de folhas-β pregueadas e que o único triptofano está parcialmente exposto ao solvente. As análises hidrodinâmicas mostraram que a LbHep1 é assimétrica e em equilíbrio entre monômeros e dímeros. Por fim, dados de ultracentrifugação analítica indicam que a LbHep1 está em equilíbrio monômero-dímero.

Leishmaniasis is an infectious disease caused by flagellate protozoa of the genus Leishmania. The parasites such as Leishmania braziliensis undergo various morphological changes during its life cycle, including the exchange of the host organism. During these changes, heat shock proteins or molecular chaperones like Hsp70, for example, are expressed in large amounts. The function of Hsp70 is to assist in the process of protein folding, protein transport between the membranes and many other important cellular functions. The Hsp70 is assisted by several proteins called co-chaperones and the Hsp70-escort protein (Hep1) is one of them. This co-chaperone has been described based on its role as a stabilizer of mitochondrial Hsp70 preventing their aggregation. The objective of this study was to clone, express, purify and characterize the Hsp70 and Hep1 ortologues of Leishmania braziliensis (LbHsp70 and LbHep1). The preliminary tests showed that LbHsp70 was expressed in the insoluble form, being necessary to express the protein in inclusion bodies to attempt its refolding in order to get it in the soluble fraction. Despite LbHsp70 was obtained in the soluble fraction after refolding, it was purified as aggregates. Still trying to get the LbHsp70 in the soluble form, it was co-expressed with LbHep1 (always expressed in the soluble form), but LbHsp70 remained in the insoluble fraction of the bacterial lysate. As LbHep1 showed no expected activity when co-expressed with LbHsp70, which is citoplasmatic, we tested if LbHep1 was able to act on human mitochondrial Hsp70 which is expressed as aggregates in bacterial heterologous systems. Then, we co-expressed LbHep1 with human mitochondrial Hsp70 which allowed obtaining both proteins in the soluble fraction, in according to data presented in the literature. Once the functionality of LbHep1 was showed, we characterize this protein by biophysical methods such as circular dichroism, fluorescence spectrometry, molecular exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation analysis. The experiments showed that the secondary structure features LbHep1 composed mainly of β-sheets and that the only tryptophan is partially exposed to solvent. Hydrodynamic analysis showed that the protein is asymmetric and in equilibrium between monomers and dimers. Finally, analytical ultracentrifugation data indicate that LbHep1 is a system in equilibrium monomer-dimer.