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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.60.2018.tde-23052018-105545
Documento
Autor
Nome completo
Nathália Gonsales da Rosa Garzon
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2017
Orientador
Banca examinadora
Cabral, Hamilton (Presidente)
Almeida, Ana Marisa Fusco de
Guimarães, Luis Henrique Souza
Labate, Carlos Alberto
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
Título em português
Estudo da alteração do perfil de proteínas de fungos filamentosos em diferentes condições de cultivo utilizando ferramentas proteômicas e ensaios enzimáticos
Palavras-chave em português
Biotecnologia; Eletroforese bidimensional; Hidrolases; Proteômica; Resíduos lignocelulósicos
Resumo em português
Os fungos filamentosos são microrganismos explorados devido ao potencial biotecnológico de seus produtos, nos quais as enzimas têm papel de destaque. Apesar de serem utilizadas em diversos segmentos industriais, as enzimas compõem um mercado que esta em franca expansão e em busca de melhores níveis de produção, de novas atividades enzimáticas, e outros. Os fungos filamentosos possuem mecanismos refinados de resposta a alterações exógenas. Sendo assim, os estudos proteômicos têm se tornado uma excelente ferramenta para explorar proteínas produzidas em resposta às variações ambientais, tais como, pH, fontes de nitrogênio e carbono, temperatura e tipos de bioprocessos. Um grupo especialmente afetado por estas variações é a produção de enzimas biotecnológicas. Neste trabalho, os perfis de proteínas intracelulares e/ou de enzimas secretadas foram identificados nos bioprocessos com Fusarium oxysporum URM 7401 e Myceliophthora thermophila, submetidos a diferentes condições de cultivo. As proteínas intracelulares de Fusarium oxysporum URM 7401, cultivado em bioprocesso submerso com diferentes pH ou fontes de nitrogênio, foram extraídas do micélio e fracionadas por eletroforese bidimensional (2DE). Os spots proteicos foram selecionados e identificados por espectrometria de massas MALDI- TOF/TOF-MS/MS. As proteínas secretadas foram avaliadas quanto às suas atividades enzimáticas utilizando substratos adequados para: peptidase, lipase, amilase, ?-glicosidase, CMCase, FPase, invertase, pectinase, xilanase e lacase. As proteínas presentes nos secretomas de Fusarium oxysporum URM 7401, cultivado em bioprocesso submerso com caseína e farinha de pena, e de Myceliophthora thermophila, cultivado em bioprocesso sólido com resíduos agroindustriais, foram identificadas por espectrometria de massas LC-ESI-MS/MS e também avaliadas quanto ao potencial de sacarificação de resíduos agroindustriais (farelo de trigo, palha de arroz e palha de soja). As proteínas selecionadas e identificadas, das diferentes condições de cultivo com Fusarium oxysporum URM 7401, em conjunto com os dados de produção enzimática demonstram a influência dos parâmetros dos bioprocessos no metabolismo de compostos, crescimento celular, síntese de nutrientes, estresse oxidativo, entre outros. Além do destaque na produção de enzimas, os extratos dos cultivos com caseína e farinha de pena foram capazes de degradar resíduos agroindustriais. A capacidade lignocelulolítica, conjugada a indução da via das fosfopentoses, sugerem que Fusarium oxysporum URM 7401 também tem potencial para a realização de bioprocesso consolidado e, consequentemente, para a produção de bioetanol. As proteínas do secretoma de Myceliophthora thermophila, quantificadas em ensaios enzimático e identificadas por espectrometria de massas LC-ESI-MS/MS, reforçaram o potencial hidrolítico e oxidativo deste microrganismo, com destaque especial para o grande número de enzimas ativas sobre carboidratos (CAZy) e oxirredutases. A ação deste arsenal enzimático também foi confirmada nos ensaios de degradação com resíduos agroindustriais; e indicaram um elevado potencial para sacarificação de resíduos ii lignocelulósicos. A compreensão dos mecanismos de produção e/ou secreção de proteínas pode ser auxiliada pela proteômica. Estes mecanismos, complementados pela identificação de enzimas biotecnológicas, podem elucidar as rotas metabólicas desencadeadas pelo microrganismo; e também na elaboração de estratégias que propiciem resultados satisfatórios nos bioprocessos.
Título em inglês
Study of the modification in protein profile of filamentous fungi on different culture conditions using proteomic tools and enzymatic assays
Palavras-chave em inglês
Bidimentional electrophoresis; Biotechnology; Hydrolases; Lignocellulosic residues; Proteomic
Resumo em inglês
Filamentous fungi are very exploited due to biotechnological potential of their products, which enzymes play a prominent role. Although they have been using in several industrial segments, the enzymes belong to an expansion market, that looking for a better levels of production, novel enzymatic activities and other. Filamentous fungi have a refined mechanisms for response to exogenous alterations. Thus, the proteomic studies have been become an excellent tool to explore proteins, which are produced in response to environmental changes, such as pH, nitrogen and carbon sources, temperature and kind of bioprocesses. A protein group that can be influenced by these variations is biotechnological enzymes. In this work, the profiles of intracellular proteins and/or of secreted enzymes were identified in the bioprocesses with Fusarium oxysporum URM 7401 and Myceliophthora thermophila, submitted to different culture conditions. The intracellular proteins from Fusarium oxysporum URM 7401, cultured in submerged bioprocess with various pH values or nitrogen sources, were extracted from mycelium and fractionated by bidimentional electrophoresis (2DE). The spots were selected and identified by MALDI-TOF/TOF-MS/MS mass spectrometry. The secreted proteins were evaluated, for their enzyme activities, using suitable substrates for peptidase, lipase, amylase, ?-glucosidase, CMCase, FPase, invertase, pectinase, xylanase and laccase. The proteins in secretomes from Fusarium oxysporum URM 7401, cultured in submerged bioprocess with casein and feather meal, and from Myceliophthora thermophila, cultured in solid state bioprocess with agroindustrial residues, were identified by LC-ESI-MS/MS mass spectrometer and they were also evaluated for saccharification potential of the agroindustrial residues (wheat bran, rice straw and soybean straw). The selected and identified proteins from Fusarium oxysporum URM 7401, obtained from different culture conditions, in addition to the enzyme production showed that bioprocess parameters influence the metabolism of compounds, cell growth, synthesis of nutrient, oxidative stress, among other. Besides this prominence in enzymes production, the extracts with casein or feather meal were able to degrade agroindustrial residues. The lignocellulolytic ability, conjugated to induction of the phosphopentoses pathways, suggest that Fusarium oxysporum URM 7401 also has potential for performing consolidated bioprocess and, consequently, for bioethanol production. The secretome proteins from Myceliophthora thermophila, quantified in enzymatic assays and identified by mass spectrometer LC-ESI-MS/MS, reinforce the hydrolytic and oxidative potential from this microorganism, with special emphasis for a great number of carbohydrate-active enzymes (CAZy) and oxidoreductases. The action of this enzymatic arsenal was also confirmed by agroindustrial residue degradation assays; and indicated a high potential for lignocellulosic residue saccharifications. The understanding about protein production and/or secretion mechanisms can be supported by proteomics. These mechanisms, complemented by the identification of biotechnological enzymes, can elucidate the metabolic pathways triggered by the microorganism; and can help to design better performing bioprocesses
 
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Data de Liberação
2020-05-22
Data de Publicação
2018-06-25
 
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