O Fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da hemofilia B, o qual é baseado na administração de FIX derivado de plasma humano ou FIX recombinante. A terapia baseada nestas abordagens apresenta limitações como os altos custos e a baixa disponibilidade para a população de hemofílicos. O FIX é uma proteína complexa com grande variedade de modificações pós-traducionais e, por isso, apresenta baixa atividade específica e produtividade. A produção de um FIX recombinante com aumento na sua atividade coagulante pode contribuir para terapias de reposição e gênica mais eficazes nas quais quantidades menores das moléculas cataliticamente melhoradas serão necessárias para se obter os benefícios terapêuticos do FIX. Essa infusão diminuída poderá reduzir ou eliminar a geração de inibidores de FIX, minimizando os efeitos colaterais e reduzindo os custos do tratamento, sendo um dos desafios atuais no tratamento da hemofilia B. Nesse contexto, a engenharia genética tem se tornado uma ferramenta importante na modificação de proteínas de interesse farmacêutico visando a melhora das suas propriedades bioquímicas e biofísicas. Este trabalho teve como objetivo desenvolver novas variantes de FIX recombinante humano com aumento da sua atividade biológica. Para isso, fizemos um estudo detalhado da estrutura da proteína FIX e geramos três variantes FIX-YKALW, FIX-ALL e FIX-LLW, utilizando a técnica de mutagênese sítio dirigida. Essas variantes foram expressas em células humanas SK-Hep-1 tratadas com vitamina K e as proteínas foram caracterizadas in vitro e in vivo. A quantidade de FIX total secretada no sobrenadante celular foi similar entre as variantes FIX-YKALW e FIX-LLW (3,2 ?g/mL), enquanto FIX-ALL apresentou a menor expressão (1,8 ?g/mL), quantidades 2-3 vezes menores que de FIX controle (FIX-WT). Entretanto, a atividade biológica das variantes foi, em média, 6,2 vezes maior que FIX-WT, com atividade específica 11 vezes maior para FIX-YKALW e FIX-LLW e 24 vezes maior para FIX-ALL. FIX-YKALW apresentou a melhor geração de trombina in vitro dentre as variantes e destacou-se na avaliação da eficiência hemostática em camundongos hemofílicos B, na qual uma dose 5 vezes menor que a recomendada de FIX foi suficiente para promover uma resposta pró-coagulante. Neste trabalho foram desenvolvidas 3 novas variantes de FIX recombinante humano com maior atividade específica que o fator disponível no Sistema Único de Sáude. O FIX-ALL apresentou-se como a proteína mais potente in vitro descrita até o momento e FIX-YKALW como a mais promissora, dentre as mutantes desenvolvidas, na proteção hemostática in vivo. Estudos complementares são necessários para transpor a barreira da pesquisa para a utilização desses novos fatores de coagulação no tratamento da hemofilia B. Entretanto, esse trabalho apresenta novas proteínas com potencial de serem usadas na combinação com a terapia gênica bem como na terapia de reposição

Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factor or recombinant protein. Coagulation therapy based on these approaches has limitations as high costs and low availability to hemophilic population. FIX is a complex protein with a wide variety of post-translational modifications and, therefore, presents low specific activity and productivity. The production of recombinant FIX with enhanced coagulant activity may contribute to more effective protein replacement and gene therapies in which reduced amounts of catalytically improved molecules will be required to obtain the therapeutic benefits of FIX. This fewer infusion may reduce or eliminate the generation of FIX inhibitors, minimizing side effects and reducing treatment costs. It is one of the current challenges for hemophilia B treatment. In this context, bioengineering has become an important tool for pharmaceutical interest protein modification to improve its biochemical and biophysical properties. This study focused on development of new recombinant human FIX variants with augmented clotting activity. We performed a detailed study of FIX protein structure and generated three variants, FIX-YKALW, FIX-ALL and FIX-LLW, using site-directed mutagenesis. Such variants were expressed in SK-Hep-1 cells treated with vitamin K and they were characterized in vitro and in vivo. The amount of FIX secreted in the cell supernatant was similar between FIX-YKALW and FIX-LLW (3.2 ?g/mL), whereas FIX-ALL displayed the lowest expression (1.8 ?g/mL), 2-3 times lower than FIX-wild-type (FIX-WT). However, the clotting activities of FIX variants were 6.2 times greater than FIX-WT. FIX-YKALW e FIX-LLW showed 11-fold higher specific activity and FIX-ALL showed 24-fold higher specific activity. FIX-YKALW displayed the greatest generation of thrombin in vitro among variants and was highlighted in the evaluation of haemostatic efficiency in hemophiliac B mice, in which a dose 5 times lower than the recommended FIX replacement therapy was enough to promote a procoagulant response. We generated 3 novel recombinant human FIX variants with enhanced specific activity than FIX available on the health system. FIX-ALL with higher in-vitro potency than any other known hyperfunctional FIX variant and FIX-YKALW as the most promising variant, among the generated mutants, for in-vivo haemostatic protection. Further studies are required to overcome the barrier to research for application of new coagulation factors on hemophilia B treatment. However, we have presented new proteins with potential for therapeutic use combined with gene therapy as well as in protein replacement therapy.