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Tese de Doutorado
DOI
Documento
Autor
Nome completo
Murilo Pazin Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Dorta, Daniel Junqueira (Presidente)
Oliveira, Gisele Augusto Rodrigues de
Palmeira, Carlos Manoel Marques
Pereira, Gustavo José da Silva
Ureshino, Rodrigo Portes
Título em português
Avaliação toxicológica e ecotoxicológica dos principais representantes de éteres de difenilas polibromadas (PBDEs)
Palavras-chave em português
Autofagia
Ecotoxicidade
HepG2. Zebrafish
PBDEs
Resumo em português
Os éteres de difenilas polibromados (PBDEs) são largamente usados como retardantes de chama e têm sido detectados em diversas amostras biológicas, devido às suas características físico-químicas e bioacumuladoras, as quais fazem com que estes compostos tenham uma elevada persistência no meio ambiente. A exposição a estes compostos pode ser nociva ao homem e aos organismos vivos, uma vez que muitos estudos têm relatado que este composto possui atividade citotóxica. Desta forma, no presente estudo, investigamos o mecanismo de ação dos BDE-47, BDE-99, BDE-154 e BDE-209 sobre o processo autofágico de células HepG2, pois além de ser um processo de reciclagem de moléculas intracelular, a autofagia atua ainda na citoproteção celular. Foram realizados ensaios de imunocitoquímica para detecção de alterações no processo autofágico, no qual foi avaliado, sob microscopia de fluorescência, o padrão de distribuição das proteínas LC3-I e LC3-II; paralelamente, foi realizada a técnica de western blotting para a quantificação de três proteínas associadas ao processo de autofagia - LC3, Beclin-1 e p62. Em nossas análises de imunocitoquímica pode-se observar que os quatro PBDEs em estudo foram capazes desencadear o processo de autofagia, sendo que a magnitude do efeito tóxico foi dependente do tempo de exposição (24 e 48 horas), da concentração utilizada (0,1; 1; 5; 25 ?mol/L) e variável de acordo com o congênere em questão, sendo os BDE-47 e BDE-99 os que apresentaram maior potencial de ativação da autofagia. Além disso, esta indução de autofagia ainda pode ser detectada nos ensaios de western blotting, pois os PBDEs alteraram os níveis de LC3-II, Beclin-1 e p62, havendo um padrão de toxicidade semelhante ao visualizado nos ensaios de imunoistoquímica. Adicionalmente, devido ao fato dos PBDEs poderem se acumular no meio ambiente, principalmente em organismos aquáticos, uma análise dos efeitos destes compostos sobre um modelo ecotoxicológico foi realizada. O zebrafish (D. rerio) foi utilizado como organismoteste, a fim de avaliar a toxicidade destes contaminantes ambientais sobre seus estágios embrionários e larvais. Foram analisados endpoints de letalidade, subletalidade e teratogenicidade após a exposição aos PBDEs em estudo. Sendo que os compostos BDE-47, BDE-99 e BDE-209 (na presença de luz) apresentaram alterações em pelo menos um dos indicadores avaliados, sendo que o parâmetro mais afetado foi a inflação das bexigas natatórias, indicando uma possível teratogenicidade causada por estes compostos. Por outro lado, os BDE-154 e BDE- 209 (na ausência de luz) não causaram malformações no organismo-teste. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que estes compostos podem causar alterações na homeostase celular desencadeando o processo autofágico, sendo que se absorvidos por organismos, podem afetar o desenvolvimento de espécies como o zebrafish.
Título em inglês
Toxicological and Ecotoxicological evaluation of the main polybrominated diphenyl ethers (PBDEs)
Palavras-chave em inglês
Autophagy
Ecotoxicity
HepG2. Zebrafish
PBDEs
Resumo em inglês
Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are widely used as flame retardants and they have been detected in several biological samples due to their physicochemical and bioaccumulating characteristics, which make these compounds to have a high persistence in the environment. The exposure to these compounds can be harmful to man and other living organisms, since many studies have reported that this compound has cytotoxic activity. Thus, in the present study, we investigated the mechanism of action of the BDE-47, the BDE-99, the BDE-154 and the BDE-209 on the autophagic process of HepG2 cells, because beyond being an intracellular molecule recycling process, autophagy acts also in the cell cytoprotection. Immunocytochemistry assays were performed to detect changes in the autophagic process, in which the distribution pattern of the LC3-I and LC3-II proteins was evaluated under fluorescence microscopy. In parallel, the western blotting technique was used to quantify three proteins associated with the autophagy process - LC3, Beclin and p62. In our analyzes of immunocytochemistry it can be observed that the four PBDEs in the study were able to trigger the autophagy process, and the magnitude of the toxic effect was dependent on the exposure time (24 and 48 hours), on the used concentration (0.1; 1; 5; 25 ?mol/L), and it varies according to the congener. The BDE-47 and BDE-99 are the ones with the highest potential for autophagy activation. In addition, this autophagy induction can still be detected in the western blotting assays, because the PBDEs altered the levels of LC3-II, Beclin-1 and p62, with a similar pattern of toxicity as seen in the immunohistochemical assays. In addition, due to the fact that PBDEs may accumulate in the environment, mainly in aquatic organisms, an analysis of the effects of these compounds on an ecotoxicological model was performed. The Zebrafish (D. rerio) was used as a test organism in order to evaluate the toxicity of these environmental contaminants on their embryonic and larval stages. In this study, lethality, sublethality and teratogenicity endpoints were analyzed after exposure to the PBDEs. The BDE-47, BDE-99 and BDE-209 compounds (in the presence of light) presented alterations in at least one of the indicators evaluated, and the most affected parameter was the swim bladder inflation, indicating a possible teratogenicity caused by these compounds. On the other hand, the BDE-154 and the BDE-209 (in the absence of light) did not cause malformations in the test organism. Considering the results, it can be concluded that these compounds are able to cause changes in cellular homeostasis triggering the autophagic process, and whether absorbed by organisms, they can affect the development of species such as zebrafish.
 
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Data de Publicação
2019-07-11
 
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