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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.60.2016.tde-03102016-151311
Documento
Autor
Nome completo
Greyce Kelly Steinhorst Alcantara
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2016
Orientador
Banca examinadora
Gaitani, Cristiane Masetto de (Presidente)
Jager, Alessandra Vincenzi
Lopes, Norberto Peporine
Malfará, Wilson Roberto
Santos Neto, Álvaro José dos
Título em português
Avaliação da microextração líquido-líquido dispersiva para determinação do levetiracetam e da risperidona por técnicas cromatográficas acopladas a espectrometria de massas
Palavras-chave em português
OS-DLLME; LEV; RSP; validação; plasma; técnicas cromatográficas acopladas à espectrometria de massas
Resumo em português
A microextração líquido-líquido dispersiva baseada no uso de solventes orgânicos (OS-DLLME) vem recebendo grande destaque devido a facilidade de operação, baixo custo, rapidez e um consumo mínimo de solventes. Previamente a OS-DLLME um pré-tratamento do plasma se faz necessário a fim de propiciar a formação de uma adequada fase sedimentada. O levetiracetam (LEV) é um dos fármacos mais prescritos para o tratamento de crises epilépticas parciais e com generalizações secundárias. Assim, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para a quantificação do LEV em amostras de plasma por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC/MS). O pré-tratamento das amostras de plasma empregou ultrafiltros Amicon® (poros com tamanho de 10 kDa) que formavam um permeado adequado para a realização da OS-DLLME. A adição de 130 ?L de clorofórmio (solvente extrator) e 400 ?L de isopropanol (solvente dispersor), sem alteração na força iônica e agitação da amostra, proporcionaram 33 % de recuperação do LEV nas amostras de plasma. Tal análise foi realizada usando uma coluna de sílica fundida recoberta com Rtx-5MS (30 m × 0,25 mm x 0,25 ?m) empregando uma rampa de aquecimento. O tempo total de corrida cromatográfica foi de 9 minutos. O método apresentou-se linear no intervalo de concentração de 2 - 80 ?g mL-1 (r >= 0,99), onde os resultados foram ponderados (peso =1/x). A validade da regressão foi confirmada aplicando o teste da falta de ajuste linear. O limite inferior de quantificação (LIQ) foi de 2 ?g mL-1. Os parâmetros de precisão, exatidão, efeito matriz, efeito carry-over e estabilidade demonstraram-se em conformidade com o European Medicines Agency. Outro método foi desenvolvido e validado para a quantificação da risperidona (RSP) e seu metabólito 9-hidroxi-risperidona (9-OH-RSP) em amostras de plasma. A RSP e 9-OH-RSP correspondem a "fração ativa" do medicamento responsável pela atividade anticonvulsivante. As amostras de plasma foram pré-tratadas com ácido tricloroacético (TCA 30 %). O sobrenadante límpido foi diluído com solução de NaCl (10 %) e ajustado para o valor de pH 12, no qual foi desenvolvido a OS-DLLME. Foi adicionado um volume de 500 ?L de acetona (solvente dispersor) e 80 ?L de clorobenzeno (solvente extrator). Após otimização da extração, foi alcançado 89 % e 42 % de recuperação da RSP e 9-OH-RSP, respectivamente. Para tais análises foi empregada a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial com ionização por eletrospray (LC-MS/MS). Uma coluna Ascentis® C18 (10 cm x 4,6 mm x 2,7 ?m), fase móvel composta por tampão acetato de amônio e acetonitrila, em modo de eluição gradiente, vazão de 500 ?L min-1 e temperatura da coluna de 40 ºC foram empregados. O tempo total da corrida cromatográfica foi de 8 minutos. O método foi linear na faixa de concentração de 5 - 80 ng mL-1 (r >= 0,99), para ambos os analitos. O LIQ foi de 5 ng mL-1. Todos os demais parâmetros estavam em conformidade com a agência regulatória. Ambos os métodos foram aplicados com sucesso em amostras de plasma de paciente em tratamento com LEV ou RSP. Desta forma foi possível demonstrar aplicabilidade dos métodos bioanalíticos desenvolvidos e averiguar a concentração plasmática dos devidos fármacos no paciente
Título em inglês
Evaluation of the dispersive liquid liquid microextraction for the determination of levetiracetam and risperidone by chromatographic techniques coupled mass spectrometry
Palavras-chave em inglês
OS-DLLME; LEV; RSP; validation; plasma samples; chromatographic techniques coupled mass spectrometry
Resumo em inglês
Dispersive liquid-liquid microextraction technique based on the use of organic solvents (OS-DLLME) has received highlighted due to the easily, rapidity, low cost and low consumption of organic solvent. Prior to OS-DLLME, plasma pretreatment is necessary to provide the formation of a suitable settled phase. Levetiracetam (LEV) is one of the most prescribed drugs for the treatment-refractory partial onset seizures with or without secondary generalization. So, it was developed and validated a bioanalytical method for the quantification of LEV in plasma samples by Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS). The pretreatment of the plasma samples employed tubes of ultrafiltration Amicon® (pore size 10 kDa) in order to form a suitable permeated to carry out the OS-DLLME. The addition of 130 ?L of chloroform (extraction solvent) and 400 ?L of isopropanol (disperser solvent), without ionic strength and agitation of samples, have reached 33 % of recovery of LEV from plasma samples. This analysis was carried out using a fused silica coated Rtx-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 ?m) and a heating ramp. The run time was 9 minutes. The method was linear in the concentration range of 2 - 80 ?g mL-1 (r >= 0.99) and the results were weighted (1/x). The linear regression was confirmed by applying the lack of fit test. The lower limit of quantitation (LLOQ) was 2 ?g mL-1. The precision, accuracy, matrix effect, carry-over and stability were in agreement with European Medicines Agency. Another method was developed and validated for the quantification of risperidone (RSP) and its 9-hydroxy-risperidone metabolite (9-OH-RSP) from plasma samples. The RSP and 9-OH-RSP constitutes the total active moiety responsible for the anticonvulsant activity. Plasma samples were pretreated with trichloroacetic acid (TCA 30%). The clear supernatant was diluted with NaCl solution (10%) and adjusted to pH 12, where was developed the OS-DLLME. It was added 500 ?L of acetone (dispersing solvent) and 80 ?L of chlorobenzene (extraction solvent). After the parameters optimization, the recovery was 89% and 42% for RSP and 9-OH-RSP, respectively. It was employed liquid chromatography-electrospray-tandem-mass spectrometry (LC/ MS/MS). Ascentis® C18 column (10 cm x 4.6 mm x 2.7 ?M), ammonium acetate buffer and acetonitrile as mobile phase in gradient elution mode, at flow rate 500 ?L min-1 and column temperature of 40 °C for this analysis. The run time was 8 minutes. The method was linear in the concentration range 5 - 80 ng mL-1 (r >= 0.99) for both analytes. The LLOQ was 5 ng mL-1. All other parameters were in agreement with the regulatory agency. Both methods have been successfully applied in plasma samples from patient that receive diary doses of LEV or RSP. In this way, it was possible to present the applicability of developed bioanalytical methods and the quantitation of plasmatic concentration of these studied drugs.
 
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Data de Liberação
2020-10-03
Data de Publicação
2016-10-05
 
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