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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.6.2015.tde-28042015-105153
Documento
Autor
Nome completo
Ronalda Silva de Araujo
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2015
Orientador
Banca examinadora
Matte, Maria Helena (Presidente)
Franco, Regina Maura Bueno
Razzolini, Maria Tereza Pepe
Sato, Maria Inês Zanoli
Soares, Rodrigo Martins
Título em português
Quantificação e caracterização genotípica de Cryptosporidium spp.isolados de água bruta superficial e esgoto bruto para a monitorização em mananciais de abastecimento público na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP)
Palavras-chave em português
Àgua Bruta Superficial
Cryptosporidium
Esgoto Bruto
Genotipagem
PCR Quantitativo
Saúde Pública
Resumo em português
As doenças de veiculação hídrica, sobretudo aquelas causadas por protozoários intestinais, emergiram como um dos principais problemas de saúde pública. Diferentes aspectos são abordados sobre a biologia e a epidemiologia dos principais protozoários parasitas de transmissão hídrica. Cryptosporidium está descrito como um importante parasita associado a casos de surtos de veiculação hídrica e alimentos no mundo. A epidemiologia complexa desse protozóario e o fato de que a maioria das espécies e genótipos não pode ser diferenciada morfologicamente, aumentam o interesse por metodologias sensíveis e rápidas na detecção de espécies responsáveis pela infecção em humanos. Neste estudo foram avaliadas 50 amostras de água bruta superficial, coletadas no Rio São Lourenço da Serra (P1A) e Represa de Guarapiranga (P2A) e 50 de esgoto bruto coletadas em São Lourenço da Serra (P1E) e no poço vertical de Taboão da Serra (P2E) entre os meses de janeiro e dezembro de 2013. O isolamento dos oocistos na água foi realizado pelo Método 1623.1 e as amostras de esgoto bruto por centrifugação, separação imunomagnética (IMS). A caracterização genotípica ocorreu por meio da nested PCR, clonagem e sequenciamento com base no gene 18S rRNA comum a todas as espécies de Cryptosporidium. O ensaio de PCR em tempo real (qPCR) foi avaliado simultaneamente para detecção e quantificação de oocistos nas amostras. De acordo com os resultados obtidos pela nested PCR, Cryptosporidium foi detectado na água bruta superficial em 12 por cento (3/25) no manancial P1A e 16 por cento (4/25) no P2A. No esgoto bruto o parasito foi detectado em 20 por cento (5/25) das amostras no ponto P1E e 24 por cento (6/25) no poço vertical P2E. A qPCR detectou 52 por cento (0,79 a 1,85 oocistos/L) de amostras positivas no manancial P1A e o parasito foi detectado em 64 por cento (0,72 a 1,4 oocistos/L) no manancial P2A. No esgoto bruto 72 por cento das amostras foram positivas tanto no ponto P1E (7 a 655 oocistos/L) como no P2E (5 a 519 oocistos/L). A caracterização molecular permitiu a identificação de C. parvum e C. hominis na água bruta superficial, e C. hominis, C. parvum, e C. muris no esgoto bruto. As espécies do gênero Cryptosporidium identificadas neste estudo apresentam expressiva relevância para o desenvolvimento da doença humana. Neste sentido, as metodologias de concentração e caracterização empregadas nas análises demonstraram no geral, o potencial para aplicação em estudos de vigilância ambiental e foram úteis na diferenciação de espécies patogênicas. A presença de C. muris associada às espécies antroponóticas identificadas auxiliou na investigação de prováveis fontes de contaminação no ambiente confirmando a necessidade da expansão de medidas efetivas para proteção destes mananciais.
Título em inglês
Quantification and molecular characterization of Cryptosporidium spp. from raw surface water and raw sewage for the monitoring of public water supply sources in the metropolitan region of São Paulo
Palavras-chave em inglês
Cryptosporidium
Genotyping
Public Health
Quantitative PCR
Raw Sewage
Raw Surface Water
Resumo em inglês
Waterborne diseases, especially those caused by intestinal protozoa, have emerged as a major public health problem. Different aspects are addressed on the biology and epidemiology of most waterborne protozoan parasites. Cryptosporidium is described as an important parasite associated with cases of waterborne and food outbreaks in the world. The complex epidemiology of this protozoan, as well as the fact that most species and genotypes cannot be differentiated morphologically, increase the interest for sensitive and rapid methods for the detection of species responsible for infection in humans. In this study, 50 samples of raw surface water were collected from São Lourenço River (P1A) and Guarapiranga Dam (P2A), and 50 samples of raw sewage were collected from São Lourenço da Serra (P1E) and from Taboão da Serras vertical well (P2E), between January and December of 2013. The isolation of oocysts in water was carried out by the USEPA Method 1623.1 and raw sewage samples were processed by centrifugation, immunomagnetic separation (IMS). Genotypic characterization occurred by nested PCR, cloning and sequencing based on 18S rRNA gene, which is common to all Cryptosporidium species. Real time PCR assays (qPCR) were carried out both for detection and quantification of oocysts simultaneously in the samples. According to the results obtained by nested PCR, Cryptosporidium was detected in raw surface water in 12 per cent (3/25) of samples at P1A and in 16 per cent (4/25) at P2A. In raw sewage the parasite was detected in 20 per cent (5/25) of samples at P1E and 24 per cent (6/25) in P2E vertical well. qPCR detected 52 per cent (0.79 to 1.85 oocysts/L) of positive samples at P1A, while the parasite was detected in 64 per cent (0.72 to 1.4 oocysts/L) of samples at P2A water supply. Regarding raw sewage, 72 per cent of samples were positive both at P1E (7 to 655 oocysts/L) and P2E (5 to 519 oocysts/L Molecular characterization allowed the identification of C. parvum and C. hominis in raw surface water, and C. hominis, C. parvum and C. muris in raw sewage. Cryptosporidium species identified herein belong to a group of organisms of significant relevance in waterborne diseases. Therefore, concentration and characterization methodologies applied in our analyses showed to be useful for environmental surveillance studies, as well as they were useful in the differentiation of human pathogens. The presence of C. muris associated to anthroponotic species helped in the investigation of likely contamination sources in the environment, confirming the need of expansion in effective measures to protect these water supplies.
 
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Data de Publicação
2015-06-02
 
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