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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.59.2018.tde-03092018-133340
Documento
Autor
Nome completo
Anieli Cristina Maraschi
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
McNamara, John Campbell (Presidente)
Augusto, Alessandra da Silva
Freire, Carolina Arruda de Oliveira
Kohlsdorf, Tiana
Leone, Francisco de Assis
Título em português
O cotransportador Na+, K+, 2Cl- e a secreção de cloreto branquial em camarões Palaemonidae (Decapoda, Crustacea): padrões moleculares, fisiológicos e evolutivos
Palavras-chave em português
Osmorregulação; Transportadores iônicos; Expressão proteica; Expressão gênica; Imunofluorescência; Crustáceos decápodes; Filofisiologia; Métodos compa
Resumo em português
Como resultado do seu passado evolutivo, a família dos camarões Palaemonidae reúne representantes de ambientes osmóticos dos mais variados. Sejam de ambientes marinhos, estuarinos ou dulcícolas, estáveis ou variáveis, as espécies destes camarões mantêm a concentração osmo-iônica da hemolinfa independente da concentração do meio. Essas espécies hiper-regulam a osmolalidade e íons da hemolinfa em meio diluído e água doce e hipo-regulam em meio concentrado ou água do mar. Um importante local de transporte iônico envolvido na regulação osmo-iônica é o epitélio brânquial, pois nas membranas de seus ionócitos constituintes encontra-se um conjunto de transportadores que efetuam o movimento transepitelial de íons. Dentre estes transportadores, o simportador Na+, K+, 2Cl- (NKCC) é considerado ter um papel na secreção de sal, objetivo primário dessa investigação. Espécies representativas de habitat marinho do gênero Palaemon foram coletadas em regiões de estuário e de poça de maré, e de habitat dulcícola do gênero Macrobrachium foram coletadas em rios que desembocam no mar e também em riachos continentais sem influência do aporte salobro. Avaliou-se os limites letais de salinidade superior (LSS50) das espécies marinhas P. northropi e P. pandaliformis e dulcícolas diádromas M. acanthurus, M. olfersi, M. amazonicum que dependem de água salobra para completo desenvolvimento larval, e hololimnéticas M. potiuna e M. brasiliense com ciclo reprodutivo completo em água doce. Objetivou-se aqui (i) caracterizar os mecanismos de hiperregulação (condição controle de 18 S P. northropi, 17 S P. pandaliformis, água doce <0,5 S nas espécies de Macrobrachium) e hiporegulação [a curto (24 h) e longo prazo (120 h) em salinidade correspondente a 80% da LSS50] da osmolalidade e [Cl-] da hemolinfa, da expressão gênica e proteica e a localização por imunofluorescência do NKCC nos ionócitos branquiais; (ii) da existência de um padrão filogenético nesses parâmetros; e (iii) testar as hipóteses de um efeito da salinidade na evolução da expressão gênica e proteica desse simportador. As espécies de Palaemon apresentaram os maiores limites de tolerância ao aumento da salinidade, assim como exibiram uma maior capacidade hiporegulatória a longo prazo (120 h) comparada aos representantes de Macrobrachium. Dentre as espécies de Macrobrachium, os limites de tolerância foram maiores nas espécies diádromas do que nas hololimnéticas. Os parâmetros LSS50, osmolalidade e [Cl-] da hemolinfa demonstraram-se estruturados na filogenia, sendo as semelhanças compartilhadas justificadas pela estreita proximidade entre as espécies. As análises filogenéticas revelaram que a capacidade hiper-regulatória da [Cl-] da hemolinfa foi correlacionada com a expressão gênica do simportador NKCC nas brânquias, enquanto que a síntese proteica do NKCC parece estar associada à hiper-regulação da osmolalidade da hemolinfa. A avaliação da localização do NKCC por imunofluorescência demonstrou que o simportador está distribuído em ambas as células que compõem o epitélio das brânquias, as células pilares e células do septo intralamelar. A localização na porção inferior das franjas e no corpo da célula pilar e por toda célula do septo não diferiu entre as espécies, e também não difereiu entre as condições controle e a curto e longo prazo em salinidade elevada. Esses resultados em conjunto sugerem a importância do NKCC também na captação de sal pelas brânquias. Houve um aumento da síntese proteica do NKCC nas brânquias dos representantes de Macrobrachium, exceto M. potiuna, quando em salinidade elevada. Observou-se que este aumento é explicado pela proximidade filogenética entre as espécies. Não houve mudança na transcrição de RNAm para o NKCC apesar do aumento na síntese proteica, o que sugere uma possível regulação pós-transcricional. A reconstrução da história evolutiva da osmorregulação, incorporando o conceito de filofisiologia, revelou a existência de mecanismos em nível molecular, celular e sistêmico que evoluíram acompanhando os eventos cladogenéticos dos Palaemonidae durante a irradiação e ocupação de diferentes nichos osmóticos.
Título em inglês
The Na+,K+,2Cl- cotransporter and the gill chloride secretion in Palaemonid shrimps (Decapoda, Crustacea): molecular, physiological and evolutionary patterns.
Palavras-chave em inglês
Osmoregulation; Ionic transporters; Protein expression; Gene expression; Immunofluorescence; Decapod Crustacea; Phylophysiology; Comparative phylogene
Resumo em inglês
Owing to their evolutionary history, the shrimp family Palaemonidae includes species from widely distinct osmotic environments. Whether from marine, estuarine, or fresh waters, inhabiting stable or variable osmotic niches, these shrimps maintain the osmotic-ionic concentration of their hemolymph independently of the concentration of the external medium. These species hyper-regulate hemolymph osmolality and ions in dilute medium and fresh water and hypo-regulate this fluid in concentrated medium or seawater. The gill epithelium constitutes an important interface of ion transport, and its constituent ionocytes express an ensemble of ion transporters that enable active transepithelial ion movements. The Na+, K+, 2Cl- cotransporter (NKCC) is thought to play a significant role in compensatory salt secretion. Species representative of the marine habitat (Palaemon) were collected from estuaries and tidal pools; diadromous species from the fresh water habitat (Macrobrachium) were collected near the mouths of rivers that flow into the sea, while hololimnetic species were collected in continental streams lacking the influence of brackish waters. The critical upper salinity limits (LSS50) of the marine species P. northropi and P. pandaliformis and the diadromous freshwater species M. acanthurus, M. olfersi, M. amazonicum that depend on brackish water for complete larval development, and the hololimnetic M. potiuna and M. brasiliense that complete their reproductive cycle entirely in fresh water were established. Our objectives were to characterize the mechanisms of hyper-regulation (control condition 18 S P. northropi, 17 S P. pandaliformis, fresh water <0.5 S for Macrobrachium) and hypo-regulation [short-term (24 h) and long-term 120 h) at salinities corresponding to 80% of LSS50] of hemolymph osmolality and [Cl-], gene and protein expression, and NKCC localization for immunofluorescence in the gill ionocytes; (ii) the existence of a phylogenetic pattern in these parameters; and (iii) to test hypotheses for a salinity effect on the evolution of the gene and protein expression of this symporter. The species of Palaemon had the highest tolerance limits to increased salinity, and also exhibited a greater hypo-regulatory capacity for long-term acclimation compared to the species of Macrobrachium. Among the Macrobrachium species, the LSS50 were higher in the diadromous species than in the hololimnetic species. The parameters LSS50 and osmolality and [Cl-] of the hemolymph were phylogenetically structured, similarities being shared by closely related species. The hyper-regulatory capacity of hemolymph [Cl-] correlated with NKCC gene expression in the gills, while NKCC protein synthesis appears to be associated with hyper-regulation of hemolymph osmolality. Immunofluorescence analysis showed that the NKCC was located in both cell types that constitute the gill epithelium, the pillar cells and the septal cells. The location of the NKCC in the lower flanges and perikarya of the pillar cells and throughout the septal cells, did not differ among species, and also did not differ among control conditions or short and long-term exposure at high salinity. These results together also suggest the importance of the NKCC in salt uptake by the gills. When in high salinity there was an increase in NKCC protein synthesis in the gills of the Macrobrachium species, except for M. potiuna. This increase can be explained by the phylogenetic proximity among those species, which excludes adaptive inferences. There was no change in NKCC mRNA transcription, which suggests possible post-transcriptional regulation. The reconstruction of the evolutionary history of osmoregulation, incorporating the concept of phylophysiology, revealed the existence of mechanisms at the molecular, cellular and systemic levels that have evolved accompanying the cladogenetic events of the Palaemonidae during their radiation and occupation of different osmotic niches.
 
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doutorado.pdf (16.34 Mbytes)
Data de Publicação
2018-09-13
 
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