In recent years, the problem of drug abuse has become more complex with the emergence of new drugs, including new psychoactive substances (NPS). NPS are unknown substances, never reported before, or previously known substances that have been used in a different way. In addition to NPS, other new drugs of abuse have also emerged in forensic casework, such as 2,4- dinitrophenol (2,4-DNP), a weight loss agent illegally used that has caused many deaths and has no antidote. In this context, further studies and methods of toxicological analysis in biological fluids are required. Dried Blood Spots (DBS) have been proposed as a bioanalytical alternative for NPS determination based on application of a low volume of blood onto a paper card, reducing the volumes required for collection and extraction, making shipping easier, minimizing collection risks, and not decreasing the stability of many drugs. Another analytical approach adopted in the study of NPS is the combination of human liver microsome incubations and high resolution mass spectrometry (HRMS) for structural elucidation of potential metabolites of new drugs. Thus, the aims of this work were: (I) the development and validation of methods for NPS analysis in DBS via gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) or ultra-high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry LC-MS/MS; (II) the development of validation methods for the analysis of 2,4-DNP in blood and urine via GC-MS; and (III) in vitro metabolism studies of NPS via incubation with human liver microsomes and HRMS. As results, an alternative method was developed for the preparation of DBS, using a salt tablet for replacing the paper, for the analysis of cocaine, methamphetamine and MDMA via GC-MS, and ultrasound-assisted derivatization. However, the method is sensitive only to high concentrations of these drugs in saltsupported DBS.The ultra-high pressure liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS) screening method for classic abuse drugs and NPS had detection limits of 0.5 to 20 ng/mL, with recoveries greater than 70% (except for alpha-PVP, LSD, heroin and mitragynine). The investigated drugs were stable for up to 37 days in DBS at - 20oC, except mytraginine. At room temperature, most compounds were stable in DBS except 4- fluoro-amphetamine, acrylfentanyl, heroin, mephedrone, methylone, N-ethyl-hexedrone, pentylone, alpha-PVP and N-ethyl-pentylone. Good correlation was observed between results obtained in the analysis of authentic liquid blood samples and DBS. Good results were also obtained with the synthetic cannabinoid screening method in DBS, with detection limits between 0.5 and 2 ng/mL using UPLC-MS/MS and high stability after 20 days at room temperature or at -20oC. The confirmatory method for analysis of synthetic cathinones in DBS also yielded good results, with R2 greater than 0.99, accuracy between 4.43% - 20.0%, intra-assay precision between 5.44% - 13.3% and inter-assay precision between 9.44% - 16.1. In in vitro metabolism studies, eight, three, five, five and six Phase I metabolites were identified and characterized for 4- methyldiethcathinone (4-MDEC), 3,4-dichloroethcathinone (3,4-DCEC), tertylone, Nethylhexedrone and N-ethylhexylone, respectively. The method of analysis of 2,4-DNP also showed satisfactory results of linearity, inter-assay inaccuracy (less than 10.6%), intra-assay inaccuracy (less than 10.7%) and 92.1% recovery. Three human intoxication cases were positive, with concentrations in the range of 61.6 - 220 mg/L in urine and <3 - 114 mg / L in blood. By performing this study, it was possible to use modern methods for the analysis/study of NPS and / or traditional illicit drugs, with implications and potential for application in routine forensic analyzes.

Nos últimos anos, o problema do abuso de drogas se tornou mais complexo com o surgimento de novas drogas, incluindo as novas substâncias psicoativas (NSP). As NSP são substâncias desconhecidas, nunca antes reportadas, ou substâncias previamente conhecidas que passaram a ser usadas de modo diferente daquele para o qual foram desenvolvidas. Além das NSP, outras novas drogas de abuso também têm surgido em casos forenses, como o 2,4-dinitrofenol (2,4- DNP), um agente utilizado ilicitamente para perda de peso, que tem causado várias mortes e não possui antídoto para sua intoxicação. Nesse contexto, novos estudos e métodos de análise toxicológica em fluidos biológicos são necessários. Dried Blood Spots (DBS) têm sido propostos como uma alternativa bioanalítica para determinação de NSP utilizando um baixo volume de amostra de sangue depositado em papel, reduzindo os volumes necessários para coleta e extração, facilitando o transporte, minimizando riscos de coleta, sem reduzir a estabilidade de várias drogas. Outra abordagem analítica adotada no estudo de NSP é a combinação de incubações em microssomas hepáticos humanos e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS) para elucidação estrutural de potenciais metabólitos de novas drogas. Com isso, os objetivos do presente trabalho foram: (I) o desenvolvimento e validação de métodos para análise de NSP em DBS via cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) ou cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LCMS/MS); (II) o desenvolvimento de validação de métodos para análise de 2,4-DNP em sangue e em urina via GC-MS; e (III) o estudo do metabolismo in vitro de NSP via incubação com microssomas hepáticos e HRMS. Como resultados, foi desenvolvido um método alternativo para o preparo de DBS, utilizando uma pastilha em substituição ao papel, para análise de cocaína, metanfetamina e MDMA via GC-MS, e derivatização assistida por ultrassom. Contudo, o método é sensível apenas para concentrações elevadas dessas drogas em DBS suportado em sal. O método para triagem de drogas de abuso clássicas e NSP via cromatografia em fase líquida de ultra pressão acoplada à espectrometria de massas com analisador quadrupolo-tempo de voo (UPLC-QTOFMS) apresentou limites de detecção de 0,5 a 20 ng/mL, com recuperações superiores a 70%, exceto para alfa-PVP, LSD, heroína e mitraginina. As drogas investigadas apresentaram-se estáveis por até 37 dias em DBS a -20oC, exceto mitraginina. À temperatura ambiente, a maioria dos compostos mostrou-se estável em DBS, exceto 4-fluoro-anfetamina, acrilfentanil, heroína, mefedrona, metilona, N-etil-hexedrona, pentilona, alfa-PVP e N-etil-pentilona. Boa correlação foi observada entre resultados obtidos na análise de amostras autênticas de sangue líquido e de DBS. Bons resultados também foram obtidos com o método de triagem de canabinóides sintéticos em DBS, com limites de detecção entre 0,5 e 2 ng/mL usando UPLC-MS/MS e alta estabilidade após 20 dias à temperatura ambiente ou à - 20oC. O método confirmatório para análise de catinonas sintéticas em DBS também apresentou bons resultados, com R 2 maiores do que 0,99, exatidão média de 4,43% - 20,0%, precisão intra-ensaio média de 5,44% - 13,3% e precisão interensaio média de 9,44% - 16,1%. Nos estudos de metabolismo in vitro, foram identificados e caracterizados oito, três, cinco, cinco e seis metabólitos de Fase I para 4-MDEC, 3,4-DCEC, tertilona, N-etil-hexedrona e N-etil-hexilona, respectivamente. O método de análise da nova droga 2,4-DNP também apresentou resultados satisfatórios de linearidade, imprecisão inter-ensaio (inferior a 10,6%), imprecisão intra-ensaio (inferior a 10,7%) e recuperação de 92,1%. Três casos de intoxicação humana foram positivos, apresentando concentrações na faixa de 61.6 - 220 mg/L em urina e < 3 - 114 mg/L em sangue. Com a realização desse estudo foi possível a utilização de métodos modernos para análise de NSP e/ou drogas ilícitas tradicionais, com implicações e potencial para aplicação em análises forenses de rotina.