As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição.

The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.