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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.59.2018.tde-18042018-094959
Documento
Autor
Nome completo
Luis Felipe Santos Mendes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2017
Orientador
Banca examinadora
Costa Filho, Antônio José da (Presidente)
Almeida, Fabio Ceneviva Lacerda de
Garratt, Richard Charles
Oliva, Glaucius
Ramos, Carlos Henrique Inacio
Título em inglês
Structural and dynamic characterization of the Golgi Reassembly and Stacking Protein (GRASP) in solution
Palavras-chave em inglês
GRASP
Intrinsically disordered proteins
Molten Globule
Spectroscopy
Unconventional protein secretion
Resumo em inglês
The Golgi complex is an organelle responsible for receiving synthesized cargo from the endoplasmic reticulum for subsequent post-translations modifications, sorting and secretion. A family of proteins named Golgi Reassembly and Stacking Proteins (GRASP) is essential for the correct assembly and laterally tethering of the Golgi cisternae, a necessary structuration to keep this organelle working correctly. The GRASP structure is mainly composed of two regions: an N-terminal formed by two PDZ domains connected by a short loop (GRASP domain) and a non-conserved C-terminal region, rich in serine and proline residues. Although there are now a few crystal structures solved for the N-terminal domain, it is surprising to notice that no information is currently available regarding a full-length protein or even about dynamic and structural differences between the two PDZs in solution, which is the main functional region of this protein. Using a full-length GRASP model, we were capable of detecting the coexistence of regular secondary structures and large amounts of disordered regions. The overall structure is less compact than a regular globular protein and the high structural flexibility makes its hydrophobic core more accessible to solvent. GRASP coexist in a dynamic conformational ensemble of a µs-ms timescale. Our results indicate an unusual behavior of GRASP in solution, closely resembling a class of collapsed intrinsically disordered proteins called molten globule. We report here also the disorder-to-order transition propensities for a native molten globule-like protein in the presence of different mimetics of cell conditions. Changes in the dielectric constant (such as those experienced close to the membrane surface) seem to be the major factor capable of inducing several disorder-to-order transitions in GRASP, which seems to show very distinct behavior when in conditions that mimic the vicinity of the membrane surface as compared to those found when free in solution. Other folding factors such as molecular crowding, counter ions, pH and phosphorylation exhibit lower or no effect on GRASP secondary structure and/or stability. This is the first study focusing on understanding the disorder-to-order transitions of a molten globule structure without the need for any mild denaturing condition. Regarding the PDZs that form the GRASP domain, we observed that GRASPs are formed by a more unstable and flexible PDZ1 and much more stable and structurally well-behaved PDZ2. More than that, many of the unstable regions found in PDZ1 are in the predicted binding pocket, suggesting a structural promiscuity inside this domain that correlates with the functional promiscuity of interacting with multiple protein partners. This thesis presents the first structural characterization of a full-length GRASP, the first model of how GRASPs (or any molten globule-like protein) can be modulated by the cell during different cell functionalities and the first work in the community proving that the established idea that both PDZs are structurally equivalent is not completely right
Título em português
Caracterização estrutural e dinâmica da proteína de estruturação e compactação do complexo de Golgi (GRASP) em solução
Palavras-chave em português
Espectroscopia
GRASP
Molten Globule
Proteínas intrinsicamente desordenadas
Secreção não convencional de proteínas
Resumo em português
O complexo de Golgi é um organela responsável pela recepção de carga sintetizada no retículo endoplasmático e por subsequente modificações pós-traducionais, classificação e secreção. Uma família de proteínas chamada Golgi Reassembly and Stacking Proteins (GRASP) é essencial para o correto empilhamento das cisternas e conexões laterais das pilhas do complexo de Golgi, uma estruturação necessária para manter essa organela funcionando corretamente. A estrutura das GRASPs é composta de duas regiões principais: uma extensão N-terminal formado por dois domínios PDZ conectados por um loop (domínio GRASP) e uma região C-terminal não conservada, rica em resíduos de serina e prolina. Embora existam algumas estruturas cristalográficas resolvidas para o domínio N-terminal, é surpreendente notar que não havia nenhuma informação na literatura sobre a construção inteira de um GRASP, ou mesmo um estudo detalhado sobre os PDZs no N-terminal em solução, que é a principal região funcional dessa proteína. Usando um modelo de GRASP em sua construção completa, fomos capazes de detectar a coexistência de estruturas secundárias regulares e grandes quantidades de regiões desordenadas. A estrutura é menos compacta do que uma proteína globular e a alta flexibilidade estrutural torna o seu núcleo hidrofóbico mais acessível ao solvente. GRASPs coexistem em um conjunto conformacional dinâmico numa escala de tempo característico de s-ms. Nossos resultados indicam um comportamento incomum da GRASP em solução, similar à de uma classe de proteínas intrinsicamente desordenadas colapsadas conhecidas como glóbulos fundidos. Nós relatamos também as propensões de transição estrutural do tipo desordem-ordem para uma proteína glóbulo fundido nativa, induzidas pela presença de diferentes miméticos de condições celulares especificas. A mudança na constante dielétrica do meio (como as experimentadas próximas à superfície da membrana biológica) é o principal modulador estrutural, capaz de induzir múltiplas transições desordem-ordem na GRASP, sugerindo um comportamento muito distinto quando em condições que imitam a vizinhança da superfície da membrana em comparação com os encontrados quando livre em solução. Outros fatores de enovelamento, tais como o molecular crowding, contra-ions, pH e a fosforilação exibem efeitos menores (ou nenhum) na estrutura secundária e/ou estabilidade da GRASP. Este é o primeiro estudo focado na compreensão das transições desordem-ordem em uma estrutura do tipo glóbulo fundido sem que houvesse a necessidade de qualquer condição desnaturante. Em relação aos PDZs que formam o domínio GRASP, observamos que as GRASPs são formadas por um PDZ1 mais instável e flexível e um PDZ2 muito mais estável e estruturalmente bem comportado. Mais do que isso, muitas das regiões instáveis encontradas no PDZ1 estão no predito bolsão de ligação, sugerindo uma promiscuidade estrutural dentro desse domínio que se correlaciona com a promiscuidade funcional de interação com múltiplos parceiros proteicos. É apresentado nesta tese a primeira caracterização estrutural de uma GRASP em sua forma completa, o primeiro modelo de como as GRASPs (ou qualquer proteína em forma de glóbulo fundido) pode ser modulada estruturalmente pela célula durante diferentes funcionalidades e o primeiro trabalho na comunidade provando que a estabelecido ideia de que ambos os PDZs são estruturalmente equivalentes não é completamente correta
 
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Data de Publicação
2018-06-07
 
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