O carcinoma de pulmão é um dos tumores malignos mais incidentes e letais no mundo e possui, na maioria dos casos, um prognóstico desfavorável. Devido ao insucesso relativo dos protocolos terapêuticos atuais, há uma urgente necessidade de desenvolvimento de novos tratamentos. A enzima CTP:fosfoetanolamina citidililtransferase (Pcyt-2), que utiliza a fosfoetanolamina (PEtn) como substrato, é um regulador chave na via de Kennedy para a produção de fosfatidiletanolamina (PE). Este fosfolipídio é um dos mais abundantes nas células eucarióticas e, por conseguinte, a redução de sua produção poderia afetar diretamente a divisão celular, a autofagia e a apoptose. Em um estudo prévio, foi confirmado que a Pcyt-2 é um alvo terapêutico em células de câncer de pulmão e foram identificados dois novos compostos, protótipos para o desenvolvimento racional de inibidores da enzima Pcyt-2: o CHY-1 e o SF2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos citotóxicos e os mecanismos inibitórios na autofagia dos novos compostos em carcinoma de pulmão de células não pequenas (CPCNP). Os resultados indicaram que CHY-1 apresenta efeito in vitro superior ao paclitaxel e cisplatina, além disso, a combinação em dose sub-tóxica de CHY-1 com cisplatina e CHY-1 com paclitaxel apresentaram efeitos citotóxicos superiores aos respectivos ativos isolados. Além disso, CHY-1 foi capaz de induzir estresse do retículo endoplasmático (RE) e reduzir o fluxo autofágico. Possivelmente o SF2, um intermediário de CHY-1, está relacionado estruturalmente com o seu grupo farmacofórico. No modelo tridimensional com a linhagem A549, foi observado que a combinação de cisplatina com SF2 é muito mais eficiente quando comparado com os tratamentos individuais, desestabilizando o esferoide pela perda de matriz extracelular. Entretanto os mesmos resultados também foram observados para MRC-5, um fibroblasto não tumoral. Foi demonstrado que o SF2 inibe a enzima Pcyt-2 e o transporte de etanolamina para o RE, e, desta maneira, reduz a produção de PE. Os resultados do ensaio de Anexina/PI indicaram que a combinação de SF2 com cisplatina induz preferencialmente apoptose, entretanto, não apresentaram efeitos sinérgicos. O SF2 foi capaz de reduzir o potencial elétrico da membrana mitocondrial das células A549 e NCI-H460, indicando a participação mitocondrial no processo de morte celular. Além disso, o SF2 se mostrou capaz de diminuir o fluxo autofágico, observado pela diminuição das proteínas: ATG5, ATG7, Beclin-1 e LC3 I e II, por Western blotting, resultados semelhantes ao previamente demonstrado por CHY-1 na linhagem A549. Pela técnica de CRISPR/Cas9 (do inglês: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), foram obtidas as células A549 knockout para os genes envolvidos no processo autofágico: ATG5, ATG7 e Beclin-1. Os resultados obtidos mostraram que, por mais que todas essas proteínas estejam relacionadas com a autofagia, as células se comportaram diferente para cada silenciamento. As imagens obtidas por MET corroboram com a hipótese de que SF2 inibe a via autofágica de forma diferente da cloroquina, além de induzir alterações morfológicas da mitocôndria e RE. SF2 tem potencial para se tornar um fármaco antitumoral pela inibição da enzima Pcyt-2, levando a apoptose e redução do fluxo autofágico em modelos de CPCNP, entretanto ainda são necessários mais estudos e uma possível modificação na estrutura da molécula para potencializar o seu efeito e melhorar a seletividade a células tumorais

Lung cancer is one of the most incident and lethal malignant tumors in the world and has, in most cases, an unfavorable prognosis. Due to the relative failure of current therapeutic protocols, thus, new treatments are urgently required. The enzyme CTP: phosphoethanolamine cytidylstransferase (Pcyt-2), which uses phosphoethanolamine as substrate, is the key regulator of the Kennedy pathway for phosphatidylethanolamine (PE) production. This phospholipid is one of the most abundant in eukaryotic cells and, therefore, the reduction of its production could directly affect cell division, autophagy and apoptosis. In a previous study, it was confirmed that Pcyt-2 is a therapeutic target in lung cancer cells and two new compounds were identified, prototypes for the rational development of Pcyt-2 enzyme inhibitors: CHY-1 and SF2. The aim of this study was to evaluate the cytotoxic effects and inhibitory mechanisms on autophagy of new compounds in non-small cell lung cancer (NSCLC). The results indicated that CHY-1 has superior in vitro effect than paclitaxel and cisplatin, in addition, the sub-toxic dose combination of CHY-1 with cisplatin and CHY-1 with paclitaxel had superior cytotoxic effects than the isolated drugs. Besides, CHY-1 was able to induce endoplasmic reticulum (ER) stress and reduce autophagic flux. Possibly SF2, an intermediate of CHY-1, is structurally related to its pharmacophoric group. In the three-dimensional model with the A549 cells, it was observed that the combination of cisplatin with SF2 is more efficient when compared to individual treatments, destabilizing the spheroid due to loss of extracellular matrix. However the same results were also observed for MRC-5, a non-tumor fibroblast. SF2 has been shown to inhibit the enzyme Pcyt-2 and transport of ethanolamine to the ER, thereby reducing PE production. Using the Annexin / PI assay indicated that the combination of SF2 with cisplatin preferentially induces apoptosis, however, did not show synergistic effects. SF2 was able to decrease mitochondrial membrane potential of A549 and NCI-H460 cells, indicating mitochondrial participation in the cell death process. In addition, SF2 was able to decrease autophagic flux, observed by the reduction of proteins: ATG5, ATG7, Beclin-1 and LC3 I and II, by Western blotting, results similar to those previous shown by CHY-1 in A549 cells. By CRISPR / Cas9 technique (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), A549 knockout cells were obtained for the genes involved in the autophagic process: ATG5, ATG7 and Beclin-1. The results showed that, although all these proteins are related to autophagy, the cells behaved differently for each silencing. The images obtained by MET corroborate the hypothesis that SF2 inhibits the autophagic pathway differently from chloroquine, besides inducing morphological alterations of mitochondria and RE. SF2 has the potential to become an antitumor drug by inhibiting the Pcyt-2 enzyme, leading to apoptosis and reduction of autophagic flux in NSCLC models. However, further studies and a possible modification of the molecule structure are still needed to enhance its effect and improve selectivity to tumor cells