Anomalias no sistema de condução ventricular (VCS) têm sido associadas à arritmias e muitos dos mecanismos para a determinação do VCS permanecem desconhecidos. Nós hipotetizamos que os fibroblastos adjacentes ao VCS influenciam a maturação de cardiomiócitos para fibras de condução rápida e poderiam estar associados à arritmias pós transplante de células-tronco em modelos de infarto do miocárdio. Utilizamos coculturas de cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos e fibroblastos cardíacos para testar esta hipótese in vitro. Adicionalmente, produzimos a deleção do gene candidato IRX3 em células tronco iPS para testar a hipótese de que o IRX3 influencia a diferenciação de cardiomiócitos em células especializadas de condução cardíaca. A cocultura de fibroblastos cardíacos aumentou a expressão proteica do marcador para o VCS, Nav1.5, e alterou os transientes de cálcio intracelular (CaTs) de forma consistente com o perfil de células de condução rápida. Interessantemente, o meio condicionado por fibroblastos foi suficiente para recapitular o aumento da expressão gênica e proteica de marcadores do VCS (Gja5/Conexina 40, Scn5a/Nav1.5 e Irx3) e, também, inibir o fenótipo de cardiomiócito ventricular de trabalho (produzindo redução da área celular e diminuição da expressão de conexina 43). Mostramos também que a indução do fenótipo de condução rápida, ilustrada pelo aumento da expressão proteica da Conexina 40, requer sinalização justácrina mediada pela ativação do Notch1 nos cardiomiócitos e nos fibroblastos, como demonstrado pela inibição farmacológica da via nos dois tipos celulares. Finalmente, as hiPSC IRX3 KO originaram cardiomiócitos com perfil de expressão gênica e CaTs condizentes com cardiomiócitos ventriculares de trabalho in vitro (maior expressão de troponina I e conexina 43; menor expressão de SCN5A; CaTs mais rápidos). Em conjunto, fornecemos evidências de que os fibroblastos cardíacos secretam fatores que induzem a maturação dos cardiomiócitos para células de condução rápida de forma dependente de sinalização Notch1 e que a diferenciação para células especializadas em condução depende do gene IRX3, pois a sua deleção favoreceu o aparecimento de cardiomiócitos de trabalho, o que pode ser importante para o desenvolvimento de estratégias mais eficientes para regeneração cardíaca

Ventricular conduction system (VCS) abnormalities have been associated with arrhythmias and many of the mechanisms for determining VCS remain unknown. We hypothesized that fibroblasts adjacent to the VCS influence cardiomyocyte maturation to fast-conducting fibers and could be associated with arrhythmias following stem cell transplantation in myocardial infarction models. We used ventricular cardiomyocyte cocultures of neonatal rats and cardiac fibroblasts to test this hypothesis in vitro. Additionally, we produced the deletion of the candidate gene IRX3 in iPS stem cells to test the hypothesis that IRX3 influences cardiomyocyte differentiation in specialized cardiac conduction cells. Co-culture of cardiac fibroblasts increased the expression of the VCS marker, Nav1.5, and altered intracellular calcium transients (CaTs) consistently with the rapidly conducting cell profile. Interestingly, fibroblastconditioned media was sufficient to recapitulate the increased gene and protein expression of VCS markers (Gja5 / Connexin 40, Scn5a / Nav1.5 and Irx3) and also inhibit the ventricular working cardiomyocyte phenotype (producing reduced cell area and decreased connexin 43 expression). We have also shown that induction of the fastconducting phenotype, illustrated by the increased protein expression of Connexin 40, requires juxtacrine signaling mediated by Notch1 activation in cardiomyocytes and fibroblasts, as demonstrated by pharmacological inhibition of the pathway in both cell types. Finally, hiPSC IRX3 KO resulted in cardiomyocytes with gene expression profile and CaTs consistent with ventricular working cardiomyocytes (higher expression of troponin I and connexin 43; lower expression of SCN5A; faster CaTs) in vitro. Together, we provide evidence that cardiac fibroblasts secrete factors that induce cardiomyocyte maturation to fast-conducting cells dependent on Notch1 signaling and that differentiation to conduction-specialized cells depends on the IRX3 gene, as its deletion favored the onset of ventricular working cardiomyocytes, which may be important for the development of more efficient strategies for cardiac regeneration