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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.5.2018.tde-27092018-121302
Documento
Autor
Nome completo
Eliane Rodrigues Tsukimoto
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Rossi, Flavia (Presidente)
Burattini, Marcelo Nascimento
Júnior, João Nobrega de Almeida
Ueda, Suely Mitoi Ykko
Título em português
Avaliação de novos métodos para a cultura de anaeróbios
Palavras-chave em português
Bactérias anaeróbias
Crescimento bacteriano
Diagnóstico clínico
Espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz
Infecções por bacteroides
Infecções por clostridium
Meios de cultura
Técnicas de laboratório clínico
Resumo em português
INTRODUÇÃO: As infecções por bactérias anaeróbias são geralmente de origem endógena, polimicrobianas e mistas. Devido a sua natureza fastidiosa, essas bactérias necessitam de uma prévia incubação em meios líquidos enriquecidos, como o caldo Thioglicolato (CT) para serem recuperadas, o isolamento desses microrganismos é trabalhoso e o tempo de resposta - TAT (turn around time) estendido desse exame pode estar associado a falhas terapêuticas e ao aumento da resistência bacteriana. A cultura de anaeróbios (CANA) ainda é um desafio para os laboratórios clínicos de rotina e novas estratégias para diminuir o TAT são fundamentais para que esse exame forneça um impacto clínico significativo. OBJETIVO: Otimizar o processo de triagem da CANA pela modificação do CT; comparar a identificação dos anaeróbios pelas metodologias fenotípicas ANC (Vitek 2- bioMérieux, France) e MALDI-TOF (Vitek MS - bioMérieux, France) e verificar o impacto econômico das ações propostas MÉTODOS: O caldo de triagem CT foi modificado eluindo individualmente discos comerciais de antibióticos (em concentrações fixas) selecionados por apresentarem baixa ou nenhuma ação contra microrganismos anaeróbios e com um bom espectro de ação para os principais aeróbios associados em culturas mistas e foram escolhidos aqueles que após uma bateria de testes frente a 15 cepas dos principais anaeróbios envolvidos em infecções humanas mantiveram a viabilidade inicial. O caldo Thioglicolato modificado (CTM) foi composto pela adição dos antibióticos que apresentaram a melhor "performance" acima descrita. A sensibilidade e especificidade do CTM foram avaliadas paralelamente com CT na rotina de CANA do HCFMUSP. Para a avaliar a identificação fenotípica, 421 anaeróbios isolados no período de seis meses foram submetidos a identificação pelo ANC (Vitek 2) e MALDI-TOF (Vitek MS). Os resultados discordantes ou com baixa discriminação da espécie foram avaliados pelo sequenciamento 16S rRNA. O impacto econômico da introdução do CTM bem como os custos diretos da identificação pelo MALDI-TOF foram avaliados. RESULTADOS: O CTM foi composto por amicacina, gentamicina e aztreonam. Das 159 amostras clínicas triadas pelo CT e CTM, 11 (7%) foram positivas para CANA com as mesmas espécies isoladas em ambos os meios. Utilizando o CTM, foi obtida uma redução dos falsos positivos de 97 (61%) para 69 (43%) quando comparado ao CT (p < 0,05). O TAT do resultado negativo da CANA com o CTM foi reduzido de 14 para sete dias em 28 (18%) amostras; o CTM permitiu a liberação do resultado positivo da CANA 48 horas à frente do CT. A sensibilidade do CTM foi igual ao CT, porém a especificidade foi superior em 19%. Das 421 cepas avaliadas, 35 foram identificadas somente pelo MALDI-TOF (Vitek MS) sendo que uma (Clostridium innocum) foi identificada somente pelo sequenciamento 16S rRNA. Das 386 avaliadas por ambas as metodologias, houve uma concordância de 97% e os resultados das 13 (3%) cepas submetidas ao sequenciamento foram concordantes em 92% com o MALDI-TOF (Vitek MS) que promoveu a redução do TAT do resultado positivo em cinco dias. A implementação do CTM possibilitou uma redução de custos nessa amostragem, de R$ 2.240,00 e a identificação pelo MALDI-TOF proporcionou uma economia de R$ 7.786,00. Considerando os valores econômicos encontrados nesse estudo e projetando-os nas estatísticas de CANA do HCFMUSP em 2017, o CTM poderia proporcionar uma economia de R$ 132.560,00 /ano e o MALDI-TOF uma redução nos gastos de R$ 13.579,00/ ano CONCLUSÕES: A padronização e implementação do CTM permitiu uma um aumento significativo de especificidade da cultura anaeróbia com redução do TAT e dos custos. A utilização do MALDI-TOF diminuiu o TAT das identificações aliado a uma melhor performance de forma custo efetiva
Título em inglês
Evaluation of new methods for anaerobic bacterial culturing
Palavras-chave em inglês
Bacteria anaerobic
Bacterial growth
Bacteroides infections
Clinical diagnosis
Clinical laboratory techniques
Clostridium infections
Culture media
Spectrometry mass matrix-assisted laser desorption-ionization
Resumo em inglês
INTRODUCTION: Anaerobic bacterial infections are usually of endogenous origin, polymicrobial and mixed. Because of their fastidious nature, these bacteria require prior incubation in enriched liquid media, such as Thioglycolate broth (TB) to be recovered, the isolation of these microorganisms is laborious, and the TAT (turn around time) extended time of this examination may be associated with therapeutic failures and increased bacterial resistance. Anaerobic culture (AC) is still a challenge for routine clinical laboratories, and new strategies for lowering TAT are critical to provide a significant clinical impact. OBJECTIVE: To optimize the AC screening process by modifying the TB; Compare anaerobical identification between (Vitek 2- bioMérieux, France) and MALDI-TOF (Vitek MS - bioMérieux, France) and to verify the economic impact of the proposed actions. METHODS: TB broth was modified by eluting individually antibiotic commercial discs (at fixed concentrations) selected for low or no action against anaerobic microorganisms and with a good action spectrum for the main associated aerobes in mixed cultures. Those who maintained the initial viability after a battery of tests against 15 strains of the major anaerobes involved in human infections were selected. Modified Thioglycolate Broth (MTB) was composed of the antibiotics that presented the best performance described above. The sensitivity and specificity of MTB were evaluated in parallel with TB in the HCFMUSP AC routine. To evaluate the phenotypic identification, 421 anaerobes isolated in the six-month period were submitted to identification by ANC (Vitek 2) and MALDI-TOF (Vitek MS). Discordant results or those with low discrimination of the species were submitted to 16S rRNA sequencing. The economic impact of the introduction of MTB as well as the direct costs of MALDI-TOF identification were assessed. RESULTS: MTB was composed of amikacin, gentamicin and aztreonam. Of the 159 clinical samples screened by TB and MTB, 11 (7%) were positive for AC with the same species isolated in both media. Using MTB, a reduction of false positives was obtained from 97 (61%) to 69 (43%) when compared to TB (p < 0.05). The TAT of the negative result of the AC with the MTB was reduced from 14 to 7 days in 28 (18%) samples; the MTB allowed the release of the AC positive result 48 hours ahead of the TB. The sensitivity of MTB was equal to TB, but the specificity was higher in 19%. Of the 421 strains evaluated, 35 were identified only by MALDI-TOF (Vitek MS) and one (Clostridium innocum) was identified only by 16S rRNA sequencing. Of the 386 evaluated by both methodologies, there was a concordance of 97% and the results of the 13 (3%) strains submitted to the sequencing were concordant in 92% with the MALDI-TOF (Vitek MS) that promoted TAT of the positive result reduction in five days. The implementation of the MTB made possible a reduction of costs in this sampling, of US $ 677,00 and the identification by MALDI-TOF provided a saving of US $ 2354,00. Considering the economic values found in this study and projecting them in the HCFMUSP AC statistics in 2017, the MTB could provide savings of US $40,070.00 / year and MALDI-TOF a reduction in expenses of US $ 4,100.00 / year. CONCLUSIONS: Standardization and implementation of MTB allowed a significant increase of anaerobic culture specificity with TAT and costs reduction. The use of MALDI-TOF reduced the TAT of the identifications and also resulted in a better performance in a cost effective way
 
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Data de Publicação
2018-09-27
 
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